目的：　　1.建立标准化动物源性生物材料Gal抗原检测方法（单克隆抗Gal抗体ELISA抑制法），并应用标准化检测方法对动物细胞、组织及动物源性生物材料Gal抗原进行定量检测;　　2.对iGb3S基因敲除模型小鼠进行基因水平和蛋白水平的表型表征(Gal抗原表达和mRNA表达检测);　　3.评价iGb3S基因敲除模型对动物源性生物材料的免疫学反应特性;　　4.考察冻存全血体外热原检测法（冻存全血—IL-1β法，冻存全血—IL-6法）重复性、灵敏度、特异度，建立动物源性生物材料体外热原检测方法。　　方法：　　1.利用人工合成的Gal-BSA作为标准曲线，为骨髓瘤细胞(SP2/0)、新西兰兔血红细胞Gal抗原数重新定值;再以重新定值后的SP2/0作标准曲线，定量检测动物组织Gal抗原。　　将待测物抗原（新西兰兔兔血红细胞系列稀释液、待检样品、做标准曲线的SP2/0细胞及Gal-BSA系列稀释液）与M86特异性抗体反应后，离心取含有M86剩余抗体的上清液，再与Gal-BSA包被的固相抗原反应，计算出待测样品和标准曲线样品的结合抑制率，之后绘制相应的浓度-结合抑制率曲线，再根据曲线拟合公式计算其50％结合抑制时的浓度，比较兔血红细胞和骨髓瘤细胞50％结合抑制率，应用Gal-BSA的50％结合抑制率与做标准曲线的骨髓瘤细胞50％结合抑制率对等，对骨髓瘤细胞表面Gal抗原数进行定值，进而计算出猪的八种冻干组织及鼠的五种湿组织的Gal抗原数。　　2.建立Gal抗原检测标准化M86 ELISA抑制法定量检测细胞、组织、动物源性生物材料Gal抗原。　　应用2μg/ml的Gal-BSA包被封闭96孔板，以系列稀释的Gal-BSA加阴性基质做标准曲线，应用过量的抗Gal单克隆抗体M86与标准曲线系列稀释液及待测样品过夜反应，ELISA法检测反应剩余的M86，计算出标准曲线样品的待测样品的结合抑制率，绘制出浓度-结合抑制率曲线，通过样品结合抑制率对应标准曲线结合抑制率，即可得样品所在浓度下对应Gal-BSA的浓度，Gal-BSA抗原数己知，故而应用M86 ELISA抑制法可检测计算出兔血红细胞，猪内皮细胞，动物组织及动物源性生物材料Gal抗原。　　3.iGb3S基因敲除小鼠的表型鉴定　　以GAPDH为内参基因，提取WT小鼠，iGb3S基因敲除小鼠心、肝、脾、肺、肾五种脏器的RNA，再将其逆转录为cDNA，PCR检测小鼠五种脏器iGb3S基因的相对GAPDH基因的表达含量;同时用所建立的标准化Gal抗原检测方法检测iGb3S基因敲除小鼠心、肝、脾、肺、肾五种脏器的Gal抗原表达。　　4.iGb3S基因敲除小鼠植入动物源性生物材料后的免疫学评价　　应用周龄相同，体重相近（要求:体重:雌性23-25g，雄性28-30g）的iGb3S基因敲除小鼠，野生型C57小鼠。将动物源性生物材料（阳性参考品、脱细胞真皮、PBS）植入到WT、iGb3S基因敲除小鼠体内一个月，应用流式细胞仪检测其血浆因子及脾细胞免疫细胞和相关分子变化，进而评价动物源生物材料的免疫原性。　　5.冻存全血热原检测法重复性、敏感性、特异性评价　　应用混合的液氮冻存人全血，参考内毒素定量检查法，用系列浓度内毒素溶液与冻存血共同孵育（500μL RPMI1640+50μL blood+50μL sample），ELISA法检测孵育液中IL-6/IL-1β的含量，并对待测药品进行干扰实验。对该方法进行系统的重复性、灵敏性、特异度进行评价。　　结果：　　1.用Gal-BSA为骨髓瘤细胞(SP2/0)的Gal抗原标定，其结果为6.19×108个/细胞，与文献报道的结果相比Gal抗原数显著增高，说明其方法的灵敏性显著提高。应用骨髓瘤细胞作为参照品，所建立的M86抗体ELISA抑制法，各结合抑制曲线相关性较好，R2＞0.95。利用该方法检测猪的冻干组织抗原含量趋势为:肺＞肾＞脾＞心＞腹膜＞心包膜＞肝组织＞皮肤;小鼠的新鲜湿组织抗原含量趋势为:心＞肺＞脾＞肾＞肝。　　2.用Gal-BSA/阴性基质建立的标准化Gal抗原检测方法，具有较好的特异性与重复性，适合组织及动物源性生物材料Gal抗原的检测。应用该方法定量检测了动物组织及动物源性生物材料Gal抗原的含量:猪肝组织为(6.66±0.83)×1014/mg，肾组织为(6.32±1.01)×1017/mg真皮组织抗原数为(5.92±1.16)×1015/mg;B型硬脑（脊）膜补片:1＃材料(2.62±0.53)×1015/mg;2#材料(1.47±0.15)×1014/mg;3#材料(1.50±0.20)×1013/mg，牛跟腱组织:(8.73±0.58)×1014个抗原表位/mg;纯胶原冻干品:(5.28±0.07)×1014个抗原表位/mg;双层人工皮肤冷冻干燥半成品(20150501、20150701、20150702):(0.55±0.25)×1014、(0.69±0.25)×1014、(0.03±0.02)×1014个抗原表位/mg;双层人工皮肤（下层）（批号:20150402、20150101、20150501）:(0.04±0.004)×1014、(0.09±0.12)×1014、(0.19±0.02)×1014个抗原表位/mg;硫酸软骨素(141101):(0.4±0.01)×1013/mg。　　3.应用RT-PCR的方法对WT小鼠和iGb3S基因敲除小鼠的iGb3S基因表达进行了检测，结果显示iGb3S基因敲除小鼠的iGb3S基因己基本不表达。用标准化Gal抗原检测方法检测iGb3S基因敲除小鼠主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）的Gal抗原表达分别下降26.47％、17.36％、9.09％、46.81％、11.50％。　　4.冻存全血热原检测法中，冻存全血—IL-6法的重复性、敏感性、特异性分别为66.67％、74.07％、100％;冻存全血-IL-1β法的重复性、敏感性、特异性分别为80％、59.26％、100％。　　结论：　　1.应用重新定值后的骨髓瘤细胞作为参照品，所建立的M86抗体ELISA抑制法检测动物细胞的Gal抗原含量具有较好的敏感性和特异性，适用于动物细胞的Gal抗原检测。但存在标准曲线骨髓瘤细胞抗原数变异较大的问题，需进一步优化条件，提高实验的可重复性。　　2.应用Gal-BSA/阴性基质作为标准曲线，所建立的标准化Gal抗原检测法检测动物组织的Gal抗原含量具有较好的敏感性和特异性，重复性较好，适用于定量检测动物源性组织及动物源性生物材料Gal抗原含量。　　3.证实了iGb3S基因敲除小鼠已不再表达iGb3S mRNA;但Gal抗原表达仅减少了约10％左右，说明iGb3S基因参与了Gal抗原表达的调控，但不是主要调控基因。　　4.建立的冻存全血热原检测法其特异性较好，IL-6法的敏感性相对IL-1β法较好，而重复性IL-1β法相对高于IL-6法。由实验中样品s1、s2、s3的回收率实验可说明有些药物成分可能会干扰本实验的结果，故而根据检测样本，需加回收率实验。