稻曲病(Rice false smut)广泛发生于世界各水稻主产区,近年来来发病率不断上升,已成为水稻上的主要真菌病害之一。稻曲病菌(Ustilasinoideavirens(Cooke)Tak)特异性地侵染水稻穗部颖花,并形成稻曲球,即稻曲病的典型病症。以往对稻曲病的研究主要集中在稻曲病的侵染循环,病原菌生物学特性,稻曲病菌的遗传多样性以及稻曲毒素的研究等方面,然而对稻曲病菌的致病机理仍不明确。前期研究中,我们对稻曲病菌侵染水稻前后的差异转录组进行分析,发现132个预测分泌蛋白基因在侵染水稻后显著上调,这些基因被定义为候选效应蛋白基因。本研究在此基础上,对部分候选效应蛋白基因进行筛选,寻找能调控植物细胞免疫反应的候选效应蛋白,并进一步通过分子生物学、细胞生物学和生物信息学等手段对其进行功能分析。主要取得以下研究结果:(1)将预测的候选效应蛋白基因构建到pGR107载体上,利用农杆菌介导的本生烟瞬时表达系统,筛选到一个能够诱导本生烟细胞死亡的Uv2169基因。在大肠杆菌BL21中表达Uv2169蛋白,利用菌体裂解液注射本生烟,注射后20h通过苔盼蓝染色观察到本生烟叶片产生细胞死亡。此外,在水稻原生质体中瞬时表达Uv2169也能够引起原生质体死亡。(2)通过农杆菌介导在本生烟中瞬时表达Uv2169,1d后取本生烟叶片检测flg22诱导的活性氧爆发,发现Uv2169能够抑制ROS积累量。同时,利用qRT-PCR检测了flg22诱导的本生烟PTI相关基因(NbCYP71 d20,NbACRE31和NbACRE132)的表达量,结果显示Uv2169能够显著抑制flg22诱导的PTI相关基因的表达。此外,表达Uv2169的本生烟叶片比对照更感马铃薯疫霉菌。(3)将Uv2169在拟南芥Col-gl中异源表达发现,flg22诱导的的活性氧爆发和胼胝质积累都显著低于野生型对照。白粉菌和寄生疫霉的接菌实验结果显示,Uv2169转基因拟南芥相对于对照Col-gl更加感病:白粉菌的菌丝生长以及产孢量明显多于Col-gl;寄生疫霉能够在Uv2169转基因拟南芥中大量生长并形成病斑,而对照Col-gl中则无明显病斑形成,且叶片上的菌丝生长和产生的孢子囊数量都少于Uv2169转基因拟南芥。(4)Uv2169基因编码130个氨基酸,对其氨基酸序列进行分析发现,N端具有信号肽序列由23个氨基酸组成。通过酵母蔗糖转化酶分泌系统验证Uv2169的信号肽功能,结果显示Uv2169的信号肽能引导蔗糖转化酶分泌,证明该信号肽具有功能。(5)将Uv2169基因构建到带eYFP标记的载体上,在本生烟中瞬时表达,发现其定位于细胞质和细胞核中,去掉信号肽序列的Uvm2169也定位于细胞质和细胞核中,然而在细胞核内的荧光强度明显高于Uv2169。我们还观察了转基因拟南芥中Uv2169的亚细胞定位情况,发现Uv2169植株中的荧光强度明显高于Uvm2169植株,且在细胞膜上和细胞质中形成多个荧光亮点。(6)人工设计合成Uv2169基因的小干涉RNA,添加至稻曲病菌培养基PSA中培养,通过qRT-PCR检测稻曲病菌中的Uv21169基因的表达量,证明siRNA能够下调表达靶标基因Uv2169。在Uv2169基因下调表达的稻曲病菌中产孢量显著高于对照组,且菌落生长受到抑制,证明Uv2169基因在稻曲病菌生长发育中发挥着重要作用。综上所述,本研究利用本生烟瞬时表达系统筛选到一个能诱导细胞死亡的稻曲病菌效应蛋白基因Uv2169,该效应蛋白具有诱导本生烟和水稻细胞死亡的作用,同时对本生烟和拟南芥的免疫反应具有抑制作用。我们推测,Uv2169在调控植物免疫反应方面的双重功能可能与其表达量有关。此外,研究发现UUv2169基因的下调表达使稻曲病菌菌丝生长受抑制但促进厚垣孢子的产生。本论文的研究结果表明,效应蛋白基因Uv2169既能调控植物的免疫反应,也能影响稻曲病菌的生长发育,因此是稻曲病菌的一个重要致病因子。该研究为阐明稻曲病菌的致病机理提供了重要理论依据。