目的:1.探索Eg5和RNF20/40复合体之间的相互作用以及RNF20/40是否催化Eg5单泛素化。2.研究RNF20/40在有丝分裂期纺锤体装配过程中发挥的重要作用。3.探索RNF20/40-Eg5通路在乳腺癌发生发展过程中的功能。方法和结果:本课题分四部分进行:第一部分:为了进一步研究RNF20/40复合体的生物学活性,我们通过免疫亲和纯化和质谱分析鉴定与之相互作用的蛋白质。实验结果显示机动蛋白Eg5与RNF20/40复合体共纯化。接下来,我们利用免疫共沉淀实验和GST pull-down实验验证了这三种蛋白质之间的相互作用。同时,为了进一步研究机动蛋白Eg5与RNF20/40复合体之间的相互作用,我们还检测了这些蛋白的亚细胞定位。实验结果显示,RNF20/40复合体与Eg5在有丝分裂期的各阶段均共定位于纺锤体的两极。第二部分:RNF20/40复合体与机动蛋白Eg5之间的相互作用指引我们探索该复合体能是否催化Eg5单泛素化。我们利用串联液相色谱质谱分析蛋白条带,检测到单泛素化HA-Eg5的蛋白条带中Eg5的745位赖氨酸有+114道尔顿的质量偏移,证明在细胞内Eg5的745位赖氨酸存在单泛素化修饰,同时,我们还利用体外泛素化反应进行了验证。而放线菌酮追踪实验结果显示,RNF20或RNF40敲低后,Eg5半衰期缩短。此外,蛋白酶体抑制实验也进一步证明RNF20/40单泛素化Eg5可以增强其蛋白稳定性,防止其依赖蛋白酶体途径降解。第三部分:RNF20/40复合体稳定Eg5并且与之在有丝分裂期的各阶段均共定位于纺锤体的两极,这指引我们研究RNF20/40复合体在有丝分裂期纺锤体装配过程中发挥的功能。我们研究发现RNF20/40复合体通过稳定机动蛋白Eg5参与纺锤体装配的过程。MTT实验和平板克隆实验共同证明敲低RNF20/40或Eg5会引起MCF-7细胞生存能力显著降低。此外,流式细胞仪检测结果说明敲低RNF20/40或Eg5,以及抑制Eg5的活性,会引起MCF-7细胞G2/M期阻滞和凋亡。第四部分:为了进一步探索RNF20/40-Eg5通路在乳腺癌发生发展中的作用,我们将MCF-7细胞移植瘤植入裸鼠。实验结果显示,RNF20/40、Eg5敲低或用monastrol处理组的无胸腺小鼠体内,肿瘤生长明显被抑制。为了将这一实验现象拓展到临床病理方面,我们对人乳腺癌样本以及正常癌旁组织的目的蛋白RNF20、RNF40和Eg5进行了免疫组化染色。实验结果显示,RNF20、RNF40和Eg5在乳腺癌中的表达水平一致上调。结论:本研究证明RNF20/40复合体与机动蛋白Eg5在有丝分裂期相互作用并且参与纺锤体的装配过程。我们还发现,RNF20/40复合体催化机动蛋白Eg5单泛素化并提高其蛋白稳定性。而RNF20/40缺失会导致纺锤体装配缺陷、细胞周期阻滞和凋亡。此外,无论敲低RNF20/40还是Eg5都会抑制活体内乳腺癌的生长。值得注意的是,在人类乳腺癌样本中,RNF20/40和Eg5的表达同时上调,而Eg5的高表达与管状A型、管状B型乳腺癌患者较低的生存期相关。我们的研究揭示了RNF20/40复合体重要的纺锤体装配功能,以及RNF20/40-Eg5通路对乳腺癌发生发展的影响,为它们可能成为乳腺癌的潜在干预目标提供了有力证据。