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目的探讨正己烷毒作用对雌性大鼠Nrf2信号通路、性激素水平和雌激素受体的影响,及枸杞多糖(LBP)对正己烷的干预作用,深入揭示正己烷的生殖毒理学机制以及枸杞多糖的生殖保护作用。方法选用48只SD雌性大鼠,按体重随机分为8组,每组6只,分别为:对照(生理盐水)组,低、中、高剂量正己烷(675、1350、2700 mg/kg)单独作用组,LBP(50 mg/kg)单独作用组,LBP(50 mg/kg)+低、中、高剂量正己烷(675、1350、2700 mg/kg)联合作用组。实验第1天对正己烷单独作用组和联合作用组进行腹腔注射正己烷单次染毒,对照组及LBP单独作用组腹腔注射生理盐水,第2～4天给对照组和正己烷单独作用组灌胃生理盐水,LBP单独作用组和联合作用组灌胃LBP,均1次/天,持续3天,第5天处死动物,解剖取血清和卵巢。采取羟胺法、酶促反应法、硫代巴比妥酸法分别检测超氧化物岐化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量;酶联免疫法分别检测雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和孕激素(PROG)水平;Real-time PCR检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)和G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)的mRNA水平,Western blot检测Nrf2、ERα、ERβ和GPER1的蛋白表达水平。结果(1)正己烷单独作用和LBP与正己烷联合作用对大鼠氧化应激水平的影响:大鼠血清中,各剂量正己烷单独作用组SOD活性显著下降(P<0.05),中、高剂量正己烷单独作用组GSH-Px活性显著下降(P<0.05),MDA含量显著上升(P<0.05);卵巢中,各剂量正己烷单独作用组GSH-Px活性显著下降(P<0.05),中、高剂量正己烷单独作用组SOD活性显著下降(P<0.05),高剂量正己烷单独作用组MDA含量显著上升(P<0.05);而且血清中GSH-Px活性下降和MDA含量升高更显著,氧化应激更严重。LBP处理后,与未加LBP同剂量正己烷单独作用组相比,血清中,LBP+中剂量正己烷联合作用组GSH-Px活性显著升高(P<0.05),LBP+高剂量正己烷联合作用组SOD和GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。卵巢中,LBP+高剂量正己烷联合作用组SOD活性显著升高(P<0.05)。LBP单独作用组中,血清和卵巢中SOD、GSH-Px活性和MDA含量无显著变化。(2)正己烷单独作用和LBP与正己烷联合作用对大鼠Nrf2信号通路的影响:中、高剂量正己烷单独作用组卵巢Nrf2基因和蛋白表达均显著上调(P<0.05),下游Ⅱ相解毒酶HO-1、NQO1、GCLC基因也显著上调(P<0.05)。LBP处理后,与未加LBP同剂量正己烷单独作用组相比,LBP+中、高剂量正己烷联合作用组卵巢Nrf2基因和蛋白表达水平均显著下降(P<0.05),且HO-1、NQO1、GCLC基因表达水平也均显著下降(P<0.05),而LBP单独作用组卵巢Nrf2蛋白和HO-1、NQO1、GCLC基因均显著上调(P<0.05)。正己烷单独作用组和LBP+正己烷联合作用组中,HO-1、NQO1、GCLC基因转录水平与Nrf2转录因子表达水平间均具有高度相关性(P<0.05)。(3)正己烷单独作用和LBP与正己烷联合作用对大鼠性激素水平的影响:血清FSH、E2、PROG均呈现先上升后下降的趋势,在高剂量正己烷单独作用组下降,而LH则呈现先下降后上升的趋势,在中剂量正己烷单独作用组下降,差异无统计学意义(P>0.05)。FSH、E2和PROG的水平与正己烷剂量间存在相关性,随染毒剂量升高,呈先上升后下降趋势,在高剂量条件下水平最低(从对照组至中剂量组间:E2和PROG的相关系数r分别为:0.376和0.407,P<0.05;从中剂量组到高剂量组间:FSH和PROG的相关系数r分别为:-0.484和-0.484,P<0.05)。LBP处理后,与未加LBP同剂量正己烷单独作用组相比,LBP+中剂量正己烷联合作用组LH表达上调,LBP+高剂量正己烷联合作用组FSH、PROG表达上调,而LBP单独作用组LH表达下降。(4)正己烷单独作用和LBP与正己烷联合作用对大鼠雌激素受体的影响:中、高剂量正己烷单独作用组卵巢ERα基因和蛋白、GPER1蛋白表达显著上调,ERβ基因和蛋白、GPER1基因表达显著下调(P<0.05)。LBP处理后,与未加LBP同剂量正己烷单独作用组相比,LBP+低剂量正己烷联合作用组卵巢ERβ和GPER1蛋白表达显著下调(P<0.05),LBP+中剂量正己烷联合作用组卵巢ERα蛋白表达显著上调(P<0.05),LBP+高剂量正己烷联合作用组卵巢GPER1基因和蛋白表达显著下调(P<0.05),LBP单独作用组卵巢ERα、GPER1基因和蛋白表达显著上调(P<0.05),而卵巢ERβ蛋白表达显著下调(P<0.05)。相关性分析显示,正己烷单独作用下,Nrf2蛋白表达与ERα、GPER1蛋白表达呈正相关关系(P<0.05),而与ERβ蛋白表达呈负相关关系(P<0.05);LBP+正己烷联合作用下,Nrf2蛋白表达与GPER1蛋白的表达水平呈正相关关系(P<0.05)。结论(1)一定剂量条件下(1350、2700 mg/kg),正己烷可引起雌性大鼠血液系统和卵巢发生氧化应激,诱导Nrf2转录因子活化,上调下游Ⅱ相解毒酶的转录,发挥抗氧化应激作用。其中HO-1、NQO1、GCLC基因转录与Nrf2转录因子表达具有高度相关性。LBP对正己烷导致的氧化应激和Nrf2转录因子及其下游Ⅱ相解毒酶的表达有拮抗作用。(2)本实验条件下,正己烷染毒对雌激素分泌没有明显干扰作用,但FSH、E2和PROG的分泌水平与正己烷染毒剂量变化相关,具有一定的剂量-效应关系。LBP可缓解高剂量正己烷诱导的大鼠血清性激素FSH和PROG的下调,对下丘脑-垂体-卵巢轴有一定的保护作用。(3)一定剂量(1350、2700 mg/kg)的正己烷染毒能通过上调雌激素受体转录因子ERα、GPER1表达,下调ERβ表达引起卵巢和生殖系统紊乱。LBP通过影响GPER1敏感性,缓解其过表达,从而发挥生殖保护作用。(4)正己烷引起的氧化应激状态下,ERα、GPER1表达上调在一定程度上调控Nrf2信号通路的激活。LBP可能通过下调GPER1表达,引起Nrf2信号因子表达下降而发挥抗氧化作用。LBP单独作用可激活Nrf2信号通路,调控ERα、ERβ和GPER1的表达。