研究目的大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，出现远端脏器转移往往是其主要的死亡原因。15％-25％的患者在原发肿瘤诊断时即有肝转移，20％-35％的患者肝脏为唯一转移部位。对出现肝转移的大肠癌患者，目前主要的治疗手段是局部肝切除术、化疗或二者的联合应用，但疗效并不令人满意。临床上能获得手术切除者仅占10％-30％，化疗的效果往往也欠佳，5-FU／leucovorin(LV)作为一线化疗药物，其联合化疗的患者的平均生存时间也仅仅不足12个月。而且化疗在临床上还存在各种各样的副作用及耐药的问题。肿瘤基因治疗是上世纪90年代初兴起的一种新的肿瘤治疗策略。其原理主要是将目的基因利用基因转移技术导入靶细胞，使其表达此基因而获得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达到治疗之目的。由于基因治疗具备从基因水平上来控制肿瘤发生、发展，从而达到彻底治疗肿瘤的可能性，因而在全球范围内掀起了一股研究热潮。随着分子生物学的发展，人们对肿瘤发生、发展及转移机制研究的深入，逐渐认识到肿瘤新生血管生成在肿瘤的演进过程中具有极其重要的作用。因此，应用基因治疗的方法来抑制肿瘤新生血管的形成也成为了目前肿瘤治疗领域的研究热点之一。肝细胞生长因子(HGF)，又名扩散因子(SF)，是调节细胞、组织生命活动的多效作用分子。除具有肝脏损伤时启动肝再生的功能外，还具有显著的促细胞分裂、细胞运动、血管生成的作用。HGF的分子结构中具有4个Kringle区域(K1-4)，在HGF发挥生物学功能中具有关键作用。HGFK1是HGF分子结构中的第一个kringle结构区域，具有拮抗HGF功能的作用，从而在临床上具有抑制细胞运动及肿瘤血管生成的潜在治疗作用。我们以腺病毒相关病毒(AAV)为载体，体外构建出了AAV-HGFK1。本研究的主要目的就是通过体内外实验，观察AAV-HGFK1或联合5-氟尿嘧啶(5-fu)对大肠癌肝转移的治疗效果。方法1、通过脾脏保留法，将鼠大肠癌细胞株CT26、人大肠癌细胞lovo分别接种到balb／c裸鼠和balb／c小鼠脾脏内，制备人、鼠大肠癌细胞株肝转移动物模型。2、划痕试验检测AAV-HGFKl对CT26细胞迁移运动能力的影响。MTT法检测5-fu对CT26细胞、lovo细胞体外生长的抑制效应。3、选取合适的动物模型，将小鼠随机分为5组，每组6只，分别给予治疗：A组：PBS、B组：AAV-EGFP、C组：5-fu、D组：AAV-HGFK1、E组：AAV-HGFK1+5-fu。给药后观察其生存时间。在小鼠濒临死亡时予以处死，立即解剖观察，保留标本。4、免疫组化检测正常肝脏组织及肿瘤组织的微血管密度(MVD)、HGFK1、EGFP的表达，TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率(AI)。结果1．两种细胞株均能成功复制出小鼠肝转移动物模型，能较好的模拟大肠癌体内肝转移的过程。CT26细胞在免疫功能完整的小鼠体内，仍具有良好的成瘤性和转移率，较lovo细胞建立的裸鼠肝转移模型转移率更高，成瘤时间更短。2．划痕试验结果表明：转染了AAV-HGFK1的CT26细胞较对照组(AAV-EGFP)的细胞，其运动能力明显降低。MTT结果显示CT26细胞、lovo细胞体外均对化疗药物5-fu作用敏感。当5-fu浓度为0.1ug／ml、作用48h后，其对lovo细胞、CT26细胞生长抑制率分别为9.3％、17.1％。3．根据动物造模实验结果，选取CT26细胞制备的小鼠肝转移模型进行药物治疗实验。D组能够显著延长荷瘤小鼠的生存时间，与B组相比具有明显统计学差异[(46.6±3.63)天对(21.2±1.08)天，p＜0.01]。C组与A组相比，对小鼠生存时间有一定延长[(28.5±1.06)天对(22.5±0.85)天]，但二者之间并无统计学差异(p＞0.05)。联合应用AAV-HGFK1和5-fu，二者无协同治疗作用，E组和D组之间无统计学差异[(47.5±2.24)天对(46.6±3.63)天，p＞0.05]。4．免疫组化结果表明，HGFK1和EGFP都能在小鼠肝脏中得到较好表达。D、E组微血管密度较A、B、C组明显降低，且具有统计学差异(p＜0.01)。TUNEL结果表明C、E两组AI较A、B组有显著性增加(p＜0.01)，D组AI虽有一定程度增加，但与B组相比，二者之间无统计学差异(p＞0.05)。结论AAV-HGFK1具有明显的抗血管生成、抑制肿瘤效应。对CT26细胞接种balb／c小鼠脾脏致肝转移，通过尾静脉注射给予AAV-HGFK1治疗，能够明显的延长荷瘤小鼠的生存时间。但在该模型中，AAV-HGFK1与5-fu之间无协同治疗作用。AAV-HGFK1或许可以作为治疗大肠癌肝转移的一项新的选择。