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第一部分钛离子暴露对RAW264.7细胞增殖、迁移等行为的影响目的研究钛离子暴露对RAW264.7细胞增殖、迁移等行为的影响。方法将RAW264.7细胞作为具有巨噬细胞表型特征的巨噬细胞模型用于体外实验,与不同浓度的钛离子共培养1、3、5天,CCK-8法比较不同钛离子浓度对RAW264.7细胞增殖的影响,选择1、5、10ppm钛离子浓度作为后续实验浓度。分别用0、1、5、10ppm钛离子处理RAW264.7细胞4小时后,采用Transwell技术,检测不同处理组RAW264.7细胞24小时的迁移情况。PCR法检测不同浓度钛离子作用后RAW264.7细胞炎症相关因子TNFa,IL6、IL1β和CCL2的基因表达。结果CCK-8结果显示,10ppm以下的钛离子浓度对RAW264.7细胞的增殖无显著改变,10ppm的钛离子可以促进RAW264.7细胞的增殖,且呈时间依赖性。而超过20ppm的钛离子则会显著抑制RAW264.7细胞增殖,并促进其死亡。Transwell实验提示,1ppm的钛离子就能显著促进RAW264.7细胞的迁移能力。钛离子浓度继续增加时,RAW264.7细胞的迁移能力无明显增强。PCR结果显示,钛离子活化了RAW264.7细胞,并释放TNFa、IL6、IL1β和CCL2等炎症相关因子,且呈剂量依赖性。结论10ppm钛离子能促进RAW264.7细胞的增殖,显著提高RAW264.7细胞的迁移能力,并活化巨噬细胞,释放炎症因子。第二部分钛离子暴露对RAW264.7细胞内Hippo/YAP及NF-κB信号通路的影响目的研究钛离子暴露对RAW264.7细胞内Hippo/YAP及NF-κB信号通路的影响。方法将RAW264.7细胞与10ppm钛离子共培养4小时后,采用western blot技术检测RAW264.7细胞内Hippo/YAP信号通路关键指标YAP及NF-κB信号通路标志蛋白P-p65、P-IκBα的表达水平。同法检测10ppm钛离子共培养0、1、5、10和30分钟后,RAW264.7细胞内p-YAP和YAP的相对表达情况。将RAW264.7细胞与10ppm钛离子在爬片上共培养12小时后,采用免疫荧光染色法标记RAW264.7细胞内YAP分子和细胞核,激光共聚焦显微镜下观察YAP在RAW264.7细胞核内核外的分布情况。结果Western blot结果显示10ppm钛离子作用于RAW264.7细胞4h后,总YAP分子的表达水平下降,NF-κB信号通路标志蛋白P-p65、P-IκBα的表达水平上升。且在作用的短时间内,钛离子即下调了RAW264.7细胞内p-YAP/YAP的比例,增加了YAP的去磷酸化,活化了YAP。免疫荧光染色结果显示钛离子促进了RAW264.7细胞内的YAP由细胞质向细胞核转移。结论钛离子能够激活RAW264.7细胞内NFκB信号通路,同时活化YAP,提高YAP分子在细胞核内的分布发挥生物学效应。第三部分Hippo-YAP/NF-κB信号交联在钛离子调控RAW264.7细胞行为中的作用机制目的研究Hippo-YAP/NF-κB信号交联在钛离子调控RAW264.7细胞行为中的作用机制。方法使用巨噬细胞NF-κB通路特异性阻断剂Bay-117082抑制巨噬细胞内NF-κB信号通路。将0ppm和10ppm的钛离子分别与空白组RAW264.7细胞和Bay-117082预处理后的RAW264.7细胞共培养4小时后,利用Western blot检测YAP和NF-κB信号通路标志蛋白P-p65、P-IκBα的表达情况;构建靶向YAP的过表达质粒以上调RAW264.7细胞内YAP基因水平的表达。利用实时定量PCR检测不同转染条件下YAP基因水平的表达情况。将0、10ppm钛离子分别与转染组和阴性对照组细胞共培养4小时后,检测YAP、P-p65、P-IκBα的蛋白表达水平,荧光定量PCR检测YAP、TNFa,IL6、IL1β的基因表达水平。结果Bay-117082能有效抑制NF-κB通路标志蛋白如P-p65、P-IκBα的表达,并在一定程度上挽救了YAP的功能表达。此外,YAP过表达质粒转染RAW264.7细胞后,在10ppm钛离子作用下,NF-κB通路进一步被激活,并促进了炎症相关因子如TNFa,IL6、IL1β的表达。结论NF-κB及Hippo/YAP信号通路协同参与并调控钛离子诱导的巨噬细胞免疫反应。NF-κB通路的激活会促进巨噬细胞内YAP的降解,YAP的激活则进一步促进NF-κB通路的表达。