鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎性分化相关基因的研究

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鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎的早期死亡可能正是由于在其性分化过程中,分别来自鸡和鹌鹑的相关基因在表达上出现了差异,从而导致了早期胚胎死亡,这样胚胎死亡的主要原因就和雌激素受体及其调控的相关基因的表达密不可分。因而本研究采用ER等性分化相关基因作为首要研究对象进行了研究。为了保证后续实验采样的需要,进行了提高鸡()与鹌鹑()杂交胚胎受精率和存活率的试验研究,结果表明,连续2d输精后间隔1d,早晚采集公鸡混合精液各输精2次,并且鹌鹑处于产蛋高峰期(产蛋率在80%以上),孵化采用德国进口Grumbach旋转孵化机(温度37.8-38.6℃,湿度:60%—80%),在鹌鹑阴道浅部输精,连续2天输精,每天早晚各1次,间隔1天后再进行操作较好,可以取得较好的效果。对影响鹌鹑早期胚胎发育及性别分化的4个基因的表达进行研究。采用Wpkci基因和多重PCR鉴定鹌鹑早期胚胎的性别,在此基础上,选取早期胚胎发育不同时间点(3、4、5、6、7、8d)雌雄鹌鹑胚胎共120枚,其中雌雄各60枚,每个时间点10枚。采用Real-time PCR方法检测鹌鹑雌雄胚胎发育过程中不同时间点性别分化相关基因(3β-HSD、P-450c17、P450arom和ER)的表达,探讨了3β-HSD、P-450c17、P450arom和ER基因对鹌鹑早期胚胎发育及性别分化的影响。结果表明,鹌鹑胚胎P-450c17、P450arom和ER基因在鹌鹑胚胎发育的第4天雌性均高于雄性,其中P450arom基因仅在雌性胚胎中检测出有表达,且表达量在第4天达到最高峰(P﹤0.01),雄性胚胎整个发育过程中都无P450arom基因的表达;ER基因在鹌鹑胚胎发育第4天雌性显著高于雄性(P﹤0.05);P-450c17在鹌鹑胚胎发育第4天虽雌性高于雄性,但无显著性差异(P﹥0.05)。另外,3β-HSD在鹌鹑胚胎发育第5天达到其表达最高值,且雌性极显著高于雄性(P﹤0.01)。研究结果表明,3β-HSD、P-450c17、P450arom和ER基因在鹌鹑早期胚胎性别分化过程中起着重要的作用,尤其是在胚胎发育4~5d。为了对鸟类性别分化中起重要作用的基因进行深入分析,对家鸡性反转胚胎雌激素及相关调控基因表达模式进行了检测,分析这些性激素在鸟类性别分化调控起到的作用。选择ER、3βHSD、P450c17、P450arom4个基因为主要研究对象,采用外源注入formestane(福美司坦)和17β-estradiol(17β雌二醇)2种手段,并设置雌雄鸡胚2个对照组,检测以上基因在胚胎早期发育过程中(84h、96h、120h、144h、168h、192h)的表达变化趋势。ER、3βHSD、P450c17、P450arom基因的表达变化在注入外源激素的试验组同未注射组间,差异均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),其中ER表现为下降趋势,P450arom表达激增,3βHSD、P450c17基因表达变化缺乏明显规律。雌激素调控是一个复杂的过程,在外源激素注入过程后,原有调控模式可能会被打乱。由于类固醇激素在禽类性腺的发育中起到重要作用,因此研究催化类固醇激素生物合成的5中酶的基因表达就尤为重要。在鸡、鹌鹑及杂交种胚胎性别分化前后这段时间内,与ER相关的基因的表达情况在性分化中起着重要的作用,利用PCR鉴定胚胎性别技术,结合RT-PCR技术对3β-HSD、P-450c17、Aromatase、ER等基因的表达规律进行分析,探索不同性别、不同胚胎发育时间,雌激素受体等相关基因的表达规律,对比鸡与鹌鹑中各基因的表达情况,可以分析杂交种胚胎大量早期死亡中雌激素受体所起的作用,及其相关调控机制。研究结果表明,3β-HSD基因雌性杂交胚胎的表达峰值分别出现在3d6h(78h)、4d(96h)和5d(120h),而雄性胚胎表达明显比雌性低。P-450c17基因雌性杂交胚胎的表达峰值出现在3d6h(78h),4d内明显高于雄性,此后杂交胚胎不管雌性和雄性表达均处于很低水平。P450arom基因雌性杂交胚胎的表达峰值分别出现在3d(72h)、3d12h(84h)、4d(96)、5d(120h),雄性杂交胚胎不表达P450arom基因。ER基因雌性和雄性胚胎的表达峰值都分别出现在3d(72h)、4d12h(108h),但是雌性相对表达较高,4d(96h)、5d(120h)时表达均处于低水平,6d(144h)后表达均很低。采用RIA法测定鸡、鹌鹑及其杂交胚胎第3天—第6天每个3h时间段的雌二醇和睾酮含量。结果显示,杂交胚胎的睾酮含量明显比鸡和鹌鹑早期发育胚胎高,并且雌二醇含量呈现波动性变化,在性分化前后激素合成紊乱也是导致杂交胚胎发育异常的原因,这也初步证明了以上性激素生成过程中基因表达的异常。综合以上研究结果提示,正是由于在其性分化过程中,分别来自鸡和鹌鹑的相关基因在表达上出现了差异,从而导致了早期胚胎死亡,这样胚胎死亡的主要原因就和雌激素受体及其调控的相关基因的表达密不可分,ER在杂交种早期死亡中确实扮演了重要的角色。杂交种出现的基因表达、激素水平异常表现说明了杂交种存在着自己独特的基因表达模式,而这种模式出现的时间又与其死亡时间吻合。
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