凋亡又称为程序性细胞死亡，通过这一先天机制机体可以清除一些不需要的细胞。与坏死不同，凋亡是一种最普遍的生理性细胞死亡，通常发生于胚胎发育，组织重塑，免疫调控以及肿瘤衰退过程中。巨噬细胞作为一种重要的免疫效应细胞，其在机体免疫中的作用不可忽视，巨噬细胞的正常凋亡对其正常行使功能有着重要的意义。很多因素可以影响巨噬细胞的凋亡，其中性激素是一个不可忽视的因素。过去的研究表明睾酮（Te）能直接引起小鼠骨髓巨噬细胞（BMM）凋亡，并伴有Fas和FasL表达的升高，那么，在睾酮诱导的小鼠骨髓巨噬细胞凋亡中Fas下游的一些关键的酶是否也参与了此过程？ 实验目的： 1．探究睾酮诱导小鼠骨髓巨噬细胞发生凋亡时，Fas/FasL途径上caspase-8、caspase-3和PARP的表达情况。 2．阻断Fas/FasL途径中接头蛋白FADD的表达后，下游因子caspase-8表达的变化。 实验方法： 无菌条件下分离3周龄雌性小鼠骨髓细胞，用含有生长因子M-CSF的L929条件培养基（LCM）诱导5天，使之向巨噬细胞定向分化。用流式细胞仪测定巨噬细胞纯度并分选出F4/80阳性细胞，并将细胞分为两大组。第一组分别是空白对照组，睾酮（100nM，下同）处理组，去除M-CSF组，去除M-CSF同时用雄激素处理组。第二组用FADD反义寡核苷酸（ASODN）转染BMMs后，重复第一组的四个处理组，并以FADD错义寡核苷酸（MSODN）转染后的睾酮处理组作为对照。处理12小时后，分别通过凋亡梯形和流式细胞仪检测第一、第二组中BMMs的凋亡情况。最后通过RT-PCR、Real-time RT-PCR和Western Blot 方法检测各组中caspase-8、caspase-3和PARP基因及蛋白的表达情况。 实验结果： 经流式细胞仪检测，67.2％的贴壁细胞是F4/80阳性细胞，最大百分率可达69.7％。这些F4/80阳性细胞即BMMs。在第一组中，除对照组外，其他三组均出现了明显的凋亡梯形。第二组中，经FADD-ASODN处理的细胞，其凋亡率明显低于FADD-MSODN组。Real-time RT-PCR和Western Blot结果也显示，在睾酮诱导下，BMMs中caspase-8、caspase-3和 PARP的表达增高并激活蛋白酶原生成小片段；而FADD的反义寡核苷酸能够部分阻断由睾酮诱导的BMMs的凋亡，使得caspase-8的表达也相应减少。 实验结论： 1．睾酮在体外直接作用于小鼠骨髓巨噬细胞后，可诱导其凋亡。 2．在睾酮诱导的小鼠骨髓巨噬细胞凋亡中伴有caspase-8、caspase-3和PARP的活化。 3．FADD反义寡核苷酸能抑制睾酮诱导的小鼠骨髓巨噬细胞的凋亡。 4．在由睾酮诱导的巨噬细胞凋亡中，当Fas/FasL途径上FADD的表达被抑制后，其下游的caspase-8表达也被抑制。