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目的:体外用AngiotensinⅡ(ANGⅡ)诱导小鼠心脏成纤维细胞表达胶原,评估Regenerating islet-derived protein 3β(Reg3β)对ANGⅡ诱导心脏成纤维细胞表达胶原的影响,并探讨Reg3β抑制心脏成纤维细胞分泌胶原的机制。体内构建Coxsackie virus B3(CVB3)诱导的病毒性心肌炎模型并评估Reg3β抑制心脏纤维化的效果。方法:(1)Reg3β对ANGⅡ诱导的心脏成纤维细胞表达胶原的影响:体外用ANGⅡ和Reg3β处理小鼠心脏成纤维细胞12h,Western blot检测Collagen-I和α-SMA的蛋白水平,qRT-PCR检测MMPs、TIMPs、Collagen-I、Collagen-Ⅲ的mRNA表达水平。免疫荧光检测Collagen-I和α-SMA。此外用ANGⅡ和Reg3β处理人心脏成纤维细胞12h,Western blot和免疫荧光分别检测Collagen-I和α-SMA的蛋白水平。(2)Reg3β通过EXTL-3抑制ANGⅡ诱导心脏成纤维细胞表达胶原:Reg3β处理小鼠心脏成纤维细胞,Western blot检测EXTL-3的蛋白水平。用siEXTL-3预处理小鼠心脏成纤维细胞后联合应用ANGⅡ和Reg3β处理小鼠心脏成纤维细胞12h,Western blot检测Collagen-I和α-SMA的蛋白水平、qRT-PCR检测MMPs、TIMPs、Collagen-I、Collagen-Ⅲ的mRNA表达水平、免疫荧光检测Collagen-I和α-SMA。(3)Reg3β抑制ANGⅡ诱导心脏成纤维细胞表达胶原的分子机制:用ANGⅡ分别处理心脏成纤维细胞5min、15min、30min、45min、60min后Western blot检测Smad2/3、Erk1/2、P38的磷酸化水平和RhoA的表达量。为了验证Reg3β是否通过抑制上述通路的活化下调心脏成纤维细胞表达胶原。用Reg3β预处理心脏成纤维细胞12h后ANGⅡ处理心脏成纤维细胞30min,Western blot检测Smad2/3、Erk1/2、P38的磷酸化水平和RhoA的表达量。用TGF-β1受体抑制剂预处理心脏成纤维细胞12h后用ANGⅡ处理心脏成纤维细胞30min,Western blot检测Smad2/3、Erk1/2、P38的磷酸化水平和RhoA的表达量。体外用ANGⅡ和Reg3β处理小鼠心脏成纤维细胞12h,Western blot检测Agtr1的蛋白水平。qRTPCR和ELISA分别检测IL-6的mRNA表达水平和上清液中IL-6的浓度。IL-6和Reg3β处理心脏成纤维细胞12h,通过Western blot评估Agtr1的蛋白水平。用IL-6中和抗体预处理心脏成纤维细胞6h后再用ANGⅡ处理12h,通过Western blot评估Agtr1的蛋白水平。IL-6可导致心脏成纤维细胞中Jak1,Stat3的磷酸化,IL-6处理心脏成纤维细胞5min、15min、30min、45min、60min后收获细胞,Western blot评估Jak1和Stat3的磷酸化水平。用Reg3β预处理心脏成纤维细胞12h,然后再用IL-6处理,在相应的点收获细胞,Western blot评估Jak1和Stat3的磷酸化水平。(4)构建小鼠病毒性心肌炎模型,Reg3β对病毒性心肌炎模型小鼠心脏纤维化的治疗作用:在诱导小鼠病毒性心肌炎模型之前,通过尾静脉注射Reg3β给药。并且在诱导小鼠病毒性心肌炎模型后,每隔一天通过尾静脉注射Reg3β继续给药,在第7天和第15天颈椎脱臼处死小鼠,收集心脏组织,用多聚甲醛固定后用于病理学检查。新鲜心脏组织提取蛋白质后Western blot检测Collagen-I和α-SMA的蛋白水平。结果:(1)qRT-PCR结果显示与Control组比较,ANGⅡ组小鼠心脏成纤维细胞中Collagen-I和Collagen-ⅢmRNA水平明显增加,与ANGⅡ组比较ANGⅡ+Reg3β组小鼠心脏成纤维细胞中Collagen-I和Collagen-ⅢmRNA水平明显降低。Western blot和免疫荧光结果显示与Control组比较,ANGⅡ组小鼠心脏成纤维细胞中Collagen-I和α-SMA明显增加,与ANGⅡ组比较ANGⅡ+Reg3β组小鼠心脏成纤维细胞中Collagen-I和α-SMA明显降低。与小鼠心脏成纤维细胞相比Reg3β处理人心脏成纤维细胞也显示出相同的结果,这些结果清楚地表明Reg3β可以抑制ANGⅡ诱导心脏成纤维细胞表达胶原。(2)qRT-PCR和Western blot结果显示与Control组比较,Reg3β处理组EXTL-3 mRNA和蛋白水平明显增高。Western blot和免疫荧光结果显示siEXTL-3处理组与ANGⅡ组相比Collagen-I和α-SMA表达没有明显改变。qRT-PCR结果显示siEXTL-3处理组与ANGⅡ组相比MMP1,TIMP1 mRNA水平没有明显改变。(3)ELISA结果显示与MCF组相比MFB组中TGF-β1含量明显增高。Western blot结果显示ANGⅡ处理心脏成纤维细胞30min与0min相比p-Smad2/3、p-Erk1/2、p-P38和RhoA蛋白水平明显增加。Western blot结果显示与Control组比较ANGⅡ组心脏成纤维细胞中p-Smad2/3、p-Erk1/2、p-P38和RhoA蛋白水平增加,与ANGⅡ组比较,ANGⅡ+Reg3β组心脏成纤维细胞中p-Smad2/3、p-Erk1/2、p-P38和RhoA蛋白水平降低。与ANGⅡ组比较,ANGⅡ+TGF-β1受体抑制剂组心脏成纤维细胞中p-Smad2/3、p-Erk1/2、p-P38和RhoA蛋白水平降低。qRTPCR结果显示与Control组比较ANGⅡ组成纤维细胞中IL-6 mRNA表达水平增高,与ANGⅡ组比较ANGⅡ+Reg3β组成纤维细胞中IL-6 mRNA表达水平降低。ELISA结果显示与Control组比较ANGⅡ组成纤维细胞上清液中IL-6浓度增高,与ANGⅡ组比较ANGⅡ+Reg3β组成纤维细胞上清液中IL-6浓度降低。Western blot结果显示与Control组比较ANGⅡ组心脏成纤维细胞中Agtr1蛋白水平明显增高,与ANGⅡ组比较ANGⅡ+Reg3β组心脏成纤维细胞中Agtr1蛋白水平降低。与Control组比较IL-6组心脏成纤维细胞中Agtr1蛋白水平增高,与IL-6组比较IL-6+Reg3β组心脏成纤维细胞中Agtr1蛋白水平降低。与Control组比较ANGⅡ组心脏成纤维细胞中Agtr1蛋白水平增高,与ANGⅡ组比较ANGⅡ+IL-6中和抗体组心脏成纤维细胞中Agtr1蛋白水平降低。Western blot结果显示pSTAT3 5min开始升高直到30 min开始降低,p-JAK1 30min开始升高。与Control组比较IL-6组小鼠心脏成纤维细胞中p-STAT3,p-JAK1蛋白水平增高,与IL-6组比较,IL-6+Reg3β组小鼠心脏成纤维细胞中p-STAT3,p-JAK1蛋白水平降低。(4)在建立病毒性心肌炎模型第15天,HE染色结果显示:与15d组相比,15d+Reg3β组中观察到心脏炎性细胞浸润缓解。天狼星红染色结果显示:在建立病毒性心肌炎模型第15天,心脏进入纤维化阶段,与15d组相比,15d+Reg3β组小鼠心脏胶原沉积显著降低。Western blot结果显示:与CVB3组相比,CVB3+Reg3β组小鼠心脏中Collagen-I和α-SMA的蛋白水平明显降低。结论:(1)Reg3β可降低小鼠心脏成纤维细胞中Agtr1的表达从而抑制ANGⅡ诱导小鼠心脏成纤维细胞表达胶原。(2)ANGⅡ通过TGF-β1-Smad2/3,Erk1/2,P38和RhoA途径促进小鼠心脏成纤维细胞表达胶原。Reg3β可通过阻断TGF-β1-Smad2/3,Erk1/2,P38和RhoA途径抑制小鼠心脏成纤维细胞表达胶原。Reg3β可通过阻断IL-6/Jak1/Stat3信号通路的活化降低小鼠心脏成纤维细胞表达胶原。(3)Reg3β缓解了病毒性心肌炎小鼠心脏纤维化的进程。