肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一种致命的神经退行性疾病,其特征是选择性脑和脊髓运动神经元丧失、肌肉萎缩和变性等。虽然大多数ALS病例（90%-95%）是散发性的,但大约5%-10%是家族性的。编码超氧化物歧化酶1（SOD1）的基因突变占家族型肌萎缩侧索硬化症的20%和5%散发型ALS病例。到目前为止,ALS的确切病因尚不清楚,没有任何治疗能显著改善患者的预后。近年来,越来越多的证据表明除了运动神经元受累以外,肌肉也可能是ALS的始动因素,甚至可促发神经肌肉接头（NMJ）及运动神经元的变性,因此骨骼肌可能是突变的SOD1蛋白的毒性靶点。突变的SOD1作为一种异常折叠的蛋白,会破坏内稳态。自噬作为机体回收受损或老化的细胞器和异常折叠的蛋白的一种代谢途径,在肌肉的营养物质运输和新陈代谢,以及维持内环境稳定方面发挥着至关重要作用。血清肌酸激酶（CK）升高被认为是肌肉损伤的标志物,在肌病或肌炎中CK水平反应肌肉损伤的程度。在ALS中CK水平可以反映潜在疾病过程的严重程度和肌肉失神经的程度,甚至一些报道认为CK可能影响ALS疾病进展,然而目前仍存在争议。他汀类药物作为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-Co A）抑制剂,是目前临床上应用最广泛的药物治疗心脑血管疾病的药物,然而他汀对于肌肉疾病的作用是把双刃剑,最新研究证实,他汀类药物可能通过促进肌肉自噬,以改善肌肉功能和减轻炎症反应。但大量的报道也表明他汀存在肌毒性作用,包括肌痛、肌无力、甚至严重的横纹肌溶解症。因此,为进一步探讨骨骼肌损伤与ALS疾病进展的相关性,我们首先对我科近年来收治的ALS患者血清CK水平进行分析,进而探讨血清CK水平及肌肉指数与ALS疾病进展率的相关性,进而我们采用经典的G93ASOD1小鼠模型,观察辛伐他汀干预后转基因鼠行为学变化及肌肉病理改变,并探讨可能的机制。第一部分血清肌酸激酶与肌萎缩侧索硬化疾病进展率的相关性目的:探讨血清肌酸激酶与肌萎缩侧索硬化疾病进展率的相关性。方法:回顾性分析144例ALS患者和100例健康体检者的临床信息,分析不同亚组ALS患者肌酸激酶的差异及与疾病进展率的相关性,采用SPSS 21.0进行统计。结果:1.ALS患者血清CK水平男性与女性分别为224.6±19.3 U/L、137.8±15.1 U/L,而对照组分别为63.5±5.3 U/L、60.2±4.8 U/L,P分别为<0.001和0.023,表明无论是男性还是女性ALS患者血清CK水平均较对照组升高,差别有统计学意义。另外从年龄来看,无论是<60岁还是>60岁的ALS患者血清CK水平均较对照组明显升高（分别209.1±19.6 U/L、161.3±18.3 U/L）。2.从不同亚组来看,男性ALS患者血清CK水平高于女性ALS患者（P=0.001）;肢体起病的ALS较球部起病的ALS具有较高的血清CK水平（分别为208.9±16.7 U/L,124.1±13.1 U/L）,且有统计学意义（P=0.004）。然而ALS血清CK水平分别从年龄（<60岁/>60岁）、病程（<12月/>12月）、进展速率（<0.5/>0.5）来分析差异均无统计学意义。3.ALS患者CK水平与ALSFRS-R评分及疾病进展率不存在相关性。然而对发病部位进行调整后,我们发现肢体起病ALS患者CK和ΔFS存在弱相关（R2=0.18,P=0.006）。LBM与ALSFRS-R评分及疾病进展率之间亦不存在相关性。小结:ALS患者血清CK水平升高,与疾病进展率不存在相关性。第二部分辛伐他汀加重G93ASOD1小鼠肌肉损伤及机制探讨目的:观察辛伐他汀对G93ASOD1小鼠行为学影响及肌肉病理改变,观察辛伐他汀对G93ASOD1小鼠骨骼肌的自噬流变化,探讨引起肌肉损伤的机制;观察肌肉损伤后炎症因子的变化及其对纤维化及肌再生的影响,进一步探索辛伐他汀促进肌再生的途径及再生肌纤维的发育情况。方法:1.我们将购自美国Jackson实验室的雄性半合子携带（B6SJL-Tg（SOD1-G93A）1Gur/J）小鼠和雌性B6SJL/F1小鼠进行杂交,通过PCR进基因鉴定。随机选择63天龄雌性G93ASOD1小鼠和同窝对照WT小鼠,采取灌胃的方式分别给予20 mg/kg辛伐他汀或辅剂（羧甲基纤维素钠）观测行为学变化:加速转轮试验、转轮掉落的潜伏期、步间距测定、体重、评分等,每组18只,留取各组小鼠胫前肌作为肌肉病理及机制探讨。采用HE染色观察辛伐他汀对G93ASOD1小鼠肌肉病理改变并测量肌纤维横截面积（CSA）。2.采用western blot、免疫荧光等方法检测辛伐他汀干预后G93ASOD1小鼠肌肉自噬标记物LC3B、P62以及SOD1蛋白的表达。3.采用免疫组化染色法、免疫荧光法检测辛伐他汀干预后终末期G93ASOD1小鼠胫前肌CD68、TNF-α阳性表达;采用western blot、免疫荧光法检测辛伐他汀对不同时期G93ASOD1小鼠炎症指标TNF-α、arginase表达的影响;采用改良马松染色及collagen1免疫荧光染色检测辛伐他汀对G93ASOD1小鼠肌纤维化面积影响;采用免疫荧光法检测辛伐他汀后G93ASOD1小鼠胚胎型肌球蛋白e MHC的表达。4.采用免疫荧光法观察辛伐他汀对G93ASOD1小鼠胫前肌Pax7及Myo D1阳性细胞的表达的影响;采用免疫荧光法检测、免疫印迹检测辛伐他汀对G93ASOD1小鼠p-m TOR/m TOR和p-S6蛋白的表达的影响;采用PCR技术检测辛伐他汀对G93ASOD1小鼠肌肉MYH1、MYH2、MYH4及MYH7基因m RNA相对表达的影响。结果:1.行为学结果显示:G93ASim小鼠较G93ACon组生存期缩短（127.2±0.8天vs.135.6±0.8天）,发病时间提前（96.2±0.5天vs.101.4±0.5天）,且有统计学意义（P<0.001）。体重曲线中,随着疾病进展G93ASim小鼠较G93ACon小鼠表现出更明显的体重下降,而WTCon和WTSim小鼠无明显的体重变化。另外,ALS小鼠早期出现的运动功能障碍为后肢功能异常,加速旋转试验中G93ASim小鼠比G93ACon小鼠后肢运动异常早5天左右。同样转轮掉落的潜伏期和步间距测定表明G93ASim小鼠存在更严重的行为学变化。HE染色显示转基因小鼠典型的肌肉变性的特征神经肌肉病,G93ASim小鼠表现出更明显的小角萎缩,中心核纤维,并且可以看到少许的再生肌纤维。我们进而统计了各组单个纤肌纤维横截面积（CSA）,其大小的分布从小于60μm2到大于480μm2之间,CSA<240μm2的肌纤维G93ASim约占73%,而G93ACon为56%。除此之外WTSim与WTCon相比无差异,分别为43%和42%。上述数据表明辛伐他汀加重了G93ASOD1小鼠肌肉萎缩并且使得肌纤维面积小于240μm2的肌纤维增加了17%。2.免疫印迹结果显示与WTCon相比,终末期G93ACon中LC3和p62水平明显升高,其结果表明G93ACon自噬流的破坏;而终末期G93ASim与G93ACon相比,LC3和p62水平表现了更明显的升高,而WTSim组和WTCon之间无差异,其与免疫荧光的结果一致。从辛伐他汀干预的不同时期G93ASOD1小鼠胫前肌P62及LC3的表达来看,免疫荧光显示,从90天至终末期G93ASim组小鼠胫前肌p62及LC3阳性细胞数明显增加。同时免疫印迹结果显示G93ASim组p62和LC3均明显上调,结果表明辛伐他汀加重了G93ASOD1小鼠的自噬流缺陷。另外,辛伐他汀干预的120天和终末期G93ASim组小鼠骨骼肌中SOD1蛋白的表达均高于与对照组,从而表明G93ASim骨骼肌中的SOD1的聚集。3.对小鼠胫前肌连续切片进行CD68及TNF-α进行免疫染色,如预期,与WTCon相比,G93ACon小鼠CD68阳性细胞数量增加,而G93ASim小鼠表现出明显更高的炎症反应,相比之下WTSim与WTCon无差别。免疫荧光也证实,与G93ACon组比,辛伐他汀显著增加终末期G93ASim组55.4%的TNF-α的表达水平。另外免疫印迹显示,与G93ACon小鼠相比,终末期G93ASim中TNF-α和arginase（一种抗炎因子）水平分别显著升高50.7%和51.5%。此外从90天到终末期动态分析表明与G93ACon小鼠相比,G93ASim组二者的表达水平均增高。然而,WTCon和WTSim组两者之间无差别。改良马松染色显示,辛伐他汀显著增加了94%G93ASOD1小鼠纤维化面积,免疫荧光法显示G93ASim小鼠总胶原量增加了155.4%。将小鼠骨骼肌进行了e MHC（一种标记再生的肌源性蛋白）免疫染色,与G93ACon小鼠相比,长期辛伐他汀干预的G93ASim小鼠肌生成增加了74.4%。4.与G93ACon相比,终末期G93ASim小鼠胫前肌中Pax7+/Myo D1-表达水平明显增高（P<0.01）,同样G93ASim组中Pax7-/Myo D1+细胞较对照组表达明显增多（P<0.001）。免疫荧光显示,与G93ACon相比,G93ASim小鼠胫前肌中p-m TOR+/e MHC+细胞明显增加（P<0.001）,G93ASim中再生肌纤维中p S6阳性表达亦明显增高（P<0.01）。免疫印迹结果显示辛伐他汀干预的G93A小鼠的p-m TOR、p-S6的表达水平均较对照组显著上调（P<0.01）。PCR结果显示,与G93ACon相比,G93ASim小鼠的MYH1、MYH2和MYH7的m RNA相对水平均增加（P<0.001）。然而,MYH4的m RNA水平显示相反结果（P<0.001）,但是WTSim和WTCon小鼠两组间比较没有显著差异。小结:辛伐他汀加重了G93ASOD1小鼠骨骼肌自噬流障碍从而加重肌肉损伤,促进炎症、纤维化,并依赖于m TOR通路的激活促进肌再生。第三部分辛伐他汀加重G93ASOD1小鼠神经肌肉接头失神经支配目的:观察辛伐他汀对G93ASOD1小鼠神经肌肉接头的影响,以及再生肌纤维周围是否具有完整的神经支配。方法:1.采用免疫荧光法检测辛伐他汀干预后G93ASOD1小鼠神经肌肉接头突触后膜标记物α-银环蛇毒素及神经丝标记物SMI-32的共表达的情况。2.采用免疫荧光检测G93ASOD1小鼠再生肌纤维（e MHC标记）中神经肌肉接头突触后膜标记物α-银环蛇毒素及神经丝标记物SMI-32的共表达的情况。结果:失神经支配是至关重要的导致ALS瘫痪的病理事件。我们观察在终末期,与WTCon相比,G93ACon小鼠NMJ神经支配的比例明显下降,而与G93ACon相比,辛伐他汀明显降低G93A小鼠神经支配的比例（13.8±0.68%vs 28.4±2.4%）。然而G93ASim和G93ACon小鼠新生肌纤维的NMJ神经支配的无差别。小结:辛伐他汀加重G93ASOD1小鼠神经肌肉接头失神经支配。