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背景:类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种慢性,全身性的自身免疫疾病,主要累及各个关节。它由对抗自身抗体的适应性免疫反应造成,导致炎性因子和自身抗体的过度产生,主要由自体反应的CD4+T cells和病理性B细胞介导。在RA的病程发展过程中,TNFα起着至关重要的作用,它可以激活下游的NFKB,从而介导产生大量的炎性因子,加重炎症反应。因此目前的治疗方法都集中在如何中和TNFα的活性,并且疗效显著,但是仍有部分患者对于TNFα抑制剂并不敏感,且TNFα抑制剂的价格昂贵。Hippo信号通路被激活后,MST1/2使其下游的LATS1/2以及MOB1发生磷酸化改变并被活化。LATS1/2会在多个位点上使YAP1/TAZ发生磷酸化,磷酸化后的YAP1/TAZ将无法进入细胞核,最终留在细胞质中或被蛋白酶体系统降解。否则,未磷酸化的YAP1/TAZ将进入到细胞核中,与TEA域DNA结合转录因子（TEAD）结合,实现促进细胞增殖和分化的作用。根据本实验室前期的实验结果,证明了细胞骨架张力通过YAP1抑制TNFα介导的炎症反应。YAP1和Hippo信号通路因其在细胞增殖和机械传感中的作用而广为人知。在这里,我们发现YAP1是一种普遍的负性调节因子,它可以抑制TNFα、IL-1β和LPS诱导的炎症反应。YAP1利用富含脯氨酸结构域（PRD）和反式激活结构域（TAD）的两个小区段直接抑制这些刺激的信号通路。合成后的这两个小区段可以穿透细胞,抑制刺激信号的传递,有望成为脓毒症、自身免疫等多种疾病的潜在治疗药物。目的:探究YAP1中抑制炎症反应的区段方法:1.分别敲低HCT-8细胞的YAP1,TAZ,TEAD,LATS1和LATS2,并给予2ng/ml TNFα刺激过夜,收集细胞上清通过ELISA比较IL8的分泌水平,从而证实Hippo信号通路调控TNFα的炎症反应。并且在人体单核细胞THP-1中给予LPS/IL-1β刺激,探究YAP1对其炎症反应的影响。同时,也对人外周血单个核细胞（PBMCs）给予同样的刺激与检测,以探究YAP1在不同细胞系中的作用。2.为了进一步了解YAP1如何抑制TNFα诱导的炎症反应,我们利用Crispr/Cas9靶向PRD从而敲除YAP1。对HCT-8中的YAP1进行敲除,并给予TNFα/IL-1β刺激,检测IL8分泌情况。接下来我们利用Western-Blot探究敲低/敲除YAP1对TNFα信号通路的影响并利用免疫荧光比较YAP1在敲除组和野生型中产物的胞内定位。随后,我们对YAP1 m RNA的不同克隆型测序并与野生型比较,解释了为何YAP1 KO细胞中会有YAP1的存在。3.我们过表达了重组基因HA-YAP2,它是YAP的9种亚型中的亚型2,随后通过QPCR测定YAP1 KD/KO和YAP2 OE细胞在TNFα刺激下的基因表达水平。接着我们用免疫荧光对比HA-YAP2和内源性YAP1的胞内定位。我们通过WB研究HA-YAP2 OE对TNFα信号通路的影响。此外,我们还研究了YAP2的N-term区域对TNFα诱导的下游信号的影响和它的胞内定位。4.我们在对YAP1不同亚型测序后构建YAP9的过表达基因型,通过q PCR检测TNFα诱导下的基因表达水平。随后合成PRD和TAD肽段,在不使用转染试剂的情况下,让肽段直接渗入细胞,用TNFα刺激,检测IL8的分泌水平,并且在人外周血单个核细胞中进行同样的实验。此外,我们通过流式检测了单个肽段和两种肽段结合,对细胞炎症应答的影响。结果:1.（1）HCT-8细胞系中,TAZ/TEAD KD细胞上清中的IL8浓度升高,对TNFα应答增强,而LATS1/LATS2 KD减弱细胞对TNFα应答（2）在THP-1和PBMCs中,YAP1 KD组细胞上清中IL8浓度均升高,表示对TNFα,LPS和IL-1β的应答增强2.（1）HCT-8细胞被TNFα/IL-1β刺激后,YAP1 KO组细胞上清中IL8浓度比WT组显著升高,表示YAP1 KO细胞对TNFα/IL-1β应答增强（2）WesternBlot结果显示YAP1 KO组依然有YAP1蛋白的出现,表示敲除PRD并未完全阻止YAP1的合成（3）YAP1在KO和WT细胞中的定位没有差别（4）除M5以外,对于其他YAP1 m RNA克隆型,敲除PRD域并不能彻底阻止YAP1生成3.（1）YAP1 KD,KO,和YAP2 OE组均可提高细胞对TNFα的应答,且HA-YAP2的细胞内定位与内源性YAP1相似（2）根据WB结果显示,YAP2 OE增强了TNFα的下游信号（3）YAP2的N-term域也提高了对TNFα的应答,且YAP2 N-term域仅存在于胞质4.测序结果显示,YAP2拥有PRD片段但是缺少TAD片段拥有PRD和TAD的YAP9过表达后抑制了TNFα的应答合成后的PRD和TAD肽段均可以抑制TNFα的应答在不使用转染试剂的情况下,PRD和TAD均可抑制HCT-8和PBMCs对TNFα的应答,且抑制作用呈剂量依赖性同时使用PRD和TAD时,抑制作用更加强烈结论:Hippo信号通路的重要效应分子YAP1是促炎刺激的抑制因子,可以减弱HCT-8和PBMCs细胞对TNFα,LPS和IL-1β的应答,且YAP1对TNFα的抑制作用并不是依赖于其转录活性或核内定位。YAP1中的PRD和TAD片段可以有效抑制TNFα应答,而且它们的抑制作用都具有剂量依赖性。当PRD和TAD肽段联合使用时,对TNFα信号的抑制作用更加强烈。