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PCR技术发明至今不断得到发展和完善,在常规PCR的基础上,衍生出了多重PCR、乳化PCR、不对称PCR、原位PCR等新型PCR技术。这些新型PCR技术解决了以往PCR技术的局限性,不断推动分子生物学及相关学科的发展,也将在土壤中典型病原菌的检测中发挥重要作用。
本研究的目的是利用新型PCR扩增技术快速检测土壤中的典型病原菌如致病性大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌、小肠结肠耶尔森氏菌等。
本研究主要内容包括:(1)DNA提取方法研究,用不同试剂盒、手提方法提取土壤中总DNA并对不同方法进行比较。(2)以gyrB和16SrDNA为靶标,优化PCR扩增土壤中典型病原菌的条件,并应用于检测土壤中的病原菌。(3)优化多重PCR、乳化PCR、对称PCR扩增检测土壤中典型病原菌的条件,并应用于检测土壤中的病原菌。
本研究成功地将FastDNA(R)SPINKitfor Soil试剂盒与Mini-Bead Beater-16TM核酸提取仪相结合高效地提取出土壤微生物的总DNA,Mini-Bead Beater-16TM核酸提取仪取代了价格较昂贵的FastPrepTMFP120核酸提取仪,节约了购买仪器成本:另外用手提的方法高效提取了土壤微生物总DNA,相比试剂盒的方法大大的降低了检测成本。基于gyrB和16SrDNA靶标用PCR扩增检测土壤中的致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等典型病原菌。通过比较各病原菌的DNA序列获知gyrB靶标更适合用于相近菌种的区分。利用多重PCR的方法一次性成功扩增检测出土壤中致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和铜绿假单胞菌等五种典型病原菌,获得优化了的多重PCR扩增检测参数;获得优化了的乳化PCR扩增检测土壤中典型病原菌的参数,用乳化PCR成功扩增出土壤中大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌;获得优化了的基于gyrB靶标的不对称PCR扩增检测土壤中典型病原菌的参数,用不对称PCR成功扩增出土壤中的致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等。