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乳酸脱氢酶C4(lactate dehydrogenase-C4,LDH-C4)为LDH蛋白家族中一个特殊的同工酶,仅在哺乳动物成熟的睾丸(testis)和精子(spermatozoa)中表达,在精子的能量代谢中发挥重要作用,是精子运动、获能及受精等过程的一个关键酶,其功能或活性异常与男性不育有密切关系。本研究进一步优化了以2-羟基戊酸为LDH-C4底物检测精子LDH-C4活性的染色方法,建立了该方法酶活性积分的正常参考范围,绘制了ROC曲线,并初步得到该方法诊断的灵敏度为89.5%,特异性为91.2%。同时,开发了一种以2-羟基丁酸钠为底物的LDH-C4活性显色方法。在此基础上,对一组精子LDH-C4活性降低的特发性不育患者进行Ldhc基因突变检测,并通过T克隆加以确证。结果显示,一名患者编码区第5外显子的40位碱基产生T→G杂合突变,对应Ldhc基因的第153位密码子由TTA变为TGA,将其命名为L153X突变。为研究L153X突变引起男性不育的致病机制,本研究采用分子克隆技术,构建了野生型Ldhc的原核、真核重组载体,并利用人工诱导突变技术获得了L153X突变体的重组质粒,通过诱导表达和转染He La细胞,模拟L153X纯合、杂合突变对LDH-C4活性的影响,研究野生型和突变型C亚基间的相互作用。结果提示,纯合和杂合突变可导致LDH-C4活性的丧失或降低,且野生型和突变型C亚基间可能存在相互作用。本研究同时利用在线生物信息学软件,建立了L153X突变体的空间结构模型,并对其生物学功能进行初步预测。结果发现L153X丧失了153~332位之间的氨基酸残基以及多个酶活性位点和底物结合位点,不能自发同源聚合形成具有催化活性的四聚体。课题进一步通过精子能量代谢测定、计算机辅助精液分析(CASA)及精子获能试验,研究L153X突变对精子能量代谢、运动及功能的影响,结果发现L153X突变的精子存在能量代谢异常和获能障碍。本研究进一步证明了Ldhc基因突变可导致男性不育的假说,并从分子遗传角度为男性不育提供了新的病因学解释。此外,开发的2-羟基丁酸钠底物法测定精子LDH-C4活性值得临床推广应用。