研究背景：肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells，CSCs）具有独特的自我更新能力和控制肿瘤细胞不死的生长、转移和发病途径的发展。CSCs既可以起源于基因组不稳定和突变的正常干细胞，也可由变异的祖细胞发展而来（瞬态放大细胞）。这一现象发生的过程目前还没有完全阐明，可能是“触发”。肿瘤干细胞在一个由异质群体细胞（成纤维细胞、内皮细胞）和细胞基质组成的“小生态”中生长，这个“小生态”应该是细胞扩张的关键因素，同时可能在肿瘤治疗反应中发挥了关键作用。肿瘤干细胞具有以下的五大潜能：自我更新的能力，分化成熟后代的能力，长期生存的能力，抗药性，有目的的独立生长和转移的能力。因此肿瘤干细胞在肿瘤形成、转移及复发治疗中有着非常重要的意义。有大量临床和实验研究已经证明CSCs参与了化疗耐药性和肿瘤转移中，这导致了肿瘤患者临床治疗不佳。越来越多的证据表明，大量具有异质性的肿瘤细胞有不同的生物学特性。在这些细胞中，有一个小族群的细胞称为肿瘤干细胞，它导致了肿瘤细胞不死的生长、发展和转移。这些肿瘤细胞有相对恒定的数目，浸润、转移、迁徙能力比较强。识别和鉴定CSCs中特定的分子标记可以指导我们在肿瘤治疗中形成靶向性的有效疗法，防止肿瘤的复发。因此，我们需要检测肿瘤细胞群中的CSC，在双波长等诊断技术的帮助下，流式细胞术可以检测肿瘤细胞中的分子标记。目前已经发现肿瘤干细胞可能标志物，例如CD133、CD44、CD34、ABCG2。肿瘤干细胞可以通过一系列独特的细胞表面标记物如CD133、CD24等进行分离。在肿瘤干细胞的细胞表型（细胞表面标志）未知的情况下，侧群细胞(side population SP)分选被认为从各种组织和细胞系中分选具有干细胞潜能的起始细胞的一种有效的方法。研究认为产生SP表型是由于位于细胞膜上的ABCG2转运蛋白高表达，SP分离是基于细胞通过增加ABCG2的表达来外Hoechst33342染料的能力。目前，我们已用喉癌细胞系Hep-2进行了ABCG2的初步探索，ABCG2在SP细胞中的表达明显增高。本实验采用ABCG2shRNA质粒转染Hep-2细胞，通过药物抗性筛选稳转细胞株；通过RT-PCR和Western blot检测ABCG2沉默效果；Hep-2细胞和Hep-2shABCG2稳定转染细胞经Hoechst33342染色，流式细胞仪检测SP细胞比例，从而探讨喉癌Hep-2细胞ABCG2基因表达与SP细胞的关系，为人喉癌中肿瘤干细胞研究及临床药物治疗提供实验数据。目的：构建ABCG2shRNA稳定转染人喉癌Hep-2细胞株；探讨ABCG2基因表达与Hep-2细胞中SP细胞比例的关系。方法：1.利用脂质体法转染ABCG2shRNA真核沉默载体，嘌呤霉素筛选阳性转染细胞克隆，制备稳定转染shRNA真核沉默载体的Hep-2细胞系，用RT-PCR、Western-blot及免疫荧光法检测转染效率及ABCG2沉默效果。2.Hep-2及Hep-2-shABCG2稳定转染细胞经Hoechest33342以及维拉帕米和PI染色后，流式细胞仪检测转染后各组细胞中SP比例的变化。3.分析数据采用SPSS13.0统计学软件行χ2检验和t检验，各指标间相关性采用Pearson correlation分析，以P＜0.01为差异有统计学意义。结果：1.荧光显微镜检测在sh-ABCG2组和Sh-Con组的Hep-2细胞中可以清楚看到绿色荧光表达，细胞形态清晰可见；未转染组未见绿色荧光。2.嘌呤霉素的筛选浓度：细胞培养到2周时观察到最佳筛选浓度确定为1.0ug/ml，维持浓度为0.5ug/ml。3.RT-PCR结果显示，稳定转染Hep-2-shABCG2后，ABCG2表达量显著降低；而转染空载体组与未转染组ABCG2表达无明显差异；4.Western-blot结果显示，稳定转染细胞Hep-2-shABCG2未检测到ABCG2蛋白表达；而Hep-2-shCon与Hep-2-Con细胞均可见ABCG2表达，且无明显差异(P＜0.01)；5.FACS检测结果显示，与Hep-2-sh-Con和未转染组相比较，Hep-2-shABCG2细胞中SP细胞比例明显降低（P＜0.01）。结论：1.成功建立ABCG2shRNA稳定转染人喉癌Hep-2细胞株；2.ABCG2基因表达与SP表型一致。