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背景卵巢癌是女性死于恶性妇科肿瘤的常见病因,它的致死性主要是由于疾病早期不易被发现以及对终末期或复发性患者因体内广泛的肿瘤浸润和转移导致患者最终难以得到有效治疗所致。MicroRNA可参与肿瘤细胞的癌变,增殖,凋亡,转移,侵袭,和耐药性的产生,并有相关文献报道其可以扮演原癌基因或抑癌基因不同的角色。我们的前期实验显示卵巢良性组织中的miR-135b-3p表达量明显低于卵巢肿瘤组织。因此,我们提出猜想miR-135b-3p基因是否也如其在胰腺癌,大肠癌等相关文献报道中一样发挥癌基因的作用,可促进卵巢癌细胞侵袭转移及调控上皮-间质细胞转化(EMT)相关蛋白的表达,是否可以成为卵巢癌血清学诊断有价值的早期标志物。本实验主要探讨研究miR-135b-3p在增强上皮性卵巢癌增殖,侵袭转移,上皮-间质细胞转化中的作用和机制。本课题的主要研究内容包括以下三个方面:一.miR-135b-3p在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与不同临床病理特征的相关性二.miR-135b-3p在OVCAR-3、CAOV-3细胞中的表达及对卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响三.miR-135b-3p促进卵巢癌细胞侵袭和转移的相关机制及临床意义的研究方法 转染特异性小分子RNA抑制剂组miR-135b-3pinhibitor;(2)转染非特异性小分子RNA阴性对照组inhibitor Negative Control1.qRT-PCR检测miR-135b-3p在卵巢肿瘤组织和卵巢良性组织中的表达,分析miR-135b-3p的表达与卵巢癌临床病理特征的相关性。2.应用qRT-PCR检测多株卵巢癌细胞miR-135b-3p的表达情况进行癌细胞株的筛选;转染特异性小分子RNA抑制剂组miR-135b-3p inhibitor及转染非特异性小分子RNA阴性对照组inhibitor NC对OVCAR-3、CAOV-3细胞进行瞬时转染,检测转染前后细胞中miR-135b-3p的转染效率;CCK-8实验观察miR-135b-3p低表达后对OVCAR-3、CAOV-3细胞增殖率的影响;划痕愈合实验和Transwell迁移实验观察miR-135b-3p低表达后OVCAR-3、CAOV-3细胞迁移能力的变化;Transwell侵袭实验观察细胞侵袭能力的变化;采用免疫印迹(Western blot)实验检测相关上皮和间质的标记分子表达,研究miR-135b-3p对上皮间质转化通路的影响。3.分别在TargetScan、miRDB和PicTar三个在线预测软件上预测miR-135b-3p的靶基因,通过gene ID转换,在venny2.1.0软件上取以上预测结果的交集,确定为9个靶基因。查询miRTarBase及最新文献报道中经实验验证与侵袭转移相关的靶基因再取交集作为后续分析的miR-135b-3p靶基因集合;Western blot实验通过调控miR-135b-3p的表达观察OVCAR-3、CAOV-3细胞中ROBO1、ERK1/2、MMP-9表达量的变化;双荧光素酶检测实验验证miR-135b-3p对靶基因ROBO1是否有直接调控作用,探索miR-135b-3p对促进卵巢癌侵袭转移的作用机制。4.qRT-PCR检测26例卵巢癌患者血清和26例健康人血清中miR-135b-3p的表达水平,分析miR-135b-3p的表达特征,探讨其对卵巢癌患者临床诊断的价值。结果1.miR-135b-3p在卵巢肿瘤组织中高表达,可能发挥癌基因的功能。miR-135b-3p的高表达与卵巢癌患者的分化程度、临床分期和淋巴结转移有密切关系(均p<0.05)。2.外源性低表达miR-135b-3p显著抑制卵巢癌细胞系(OVCAR-3、CAOV-3)增殖,迁移和侵袭能力。与对照组相比,外源性低表达miR-135b-3p的卵巢癌细胞上皮及间质标志分子E-钙粘蛋白的表达上调,N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达下调。3.外源性低表达miR-135b-3p可以靶向负反馈调节ROBO1,使P-ERK和MMP-9的相对表达量降低。双荧光素酶报告显示在HEK293T细胞中,外源性高表达miR-135b-3p显著抑制了携带野生型ROBO1的3’-UTR萤光素酶活性,而携带突变型ROBO1的3’-UTR萤光素酶活性并没有受到影响。4.与健康人组比较,miR-135b-3p在卵巢癌患者血清中的表达水平明显升高(P<0.01),对卵巢癌患者有一定的临床诊断价值。结论1.miR-135b-3p在卵巢肿瘤组织及OVCAR-3、CAOV-3卵巢癌细胞株表达异常升高。miR-135b-3p促进卵巢癌细胞增殖,迁移和侵袭能力,促进上皮细胞间质转化以及促进上皮性卵巢癌远处转移。2.ROB01为miR-135b-3p直接结合的靶基因之一,miR-135b-3p通过抑制ROBO1的表达,激活ERK/MMP-9信号通路,调控ROBO1/ERK/MMP-9信号轴对卵巢癌的侵袭转移有重要作用。3.miR-135b-3p在卵巢肿瘤患者的血清中呈现异常高表达,有望成为卵巢癌早期诊断的生物标志物。