论文部分内容阅读
目的:1.观察牛磺酸对二型糖尿病(T2D)大鼠认知障碍的改善作用;2.观察牛磺酸对T2D大鼠海马区神经元凋亡的拮抗作用;3.探讨牛磺酸抗凋亡机制。方法:选用60只体重在140-180g SPF级的雄性SD大鼠,运用随机数表法进行编号分组。先分为模型组和对照组,模型组48只,对照组12只。模型组给予高脂高糖(25%蔗糖+15%猪油+1.5%胆固醇+1%胆酸钠+57.5%正常饲料)喂养4周,对照组给予正常饮食。模型组空腹后给予链脲佐菌素(STZ)注射,将STZ溶于柠檬酸缓冲液中,按25mg/kg剂量进行腹腔注射。注射72小时后,用血糖仪进行血糖检测,随机血糖值大于等于16.7mmol/L视为造模成功,未成模的鼠一周后再小剂量注射STZ,同时检测血糖值。对照组给予柠檬酸缓冲液腹腔注射。建模成功后将模型组分为二型糖尿病(T2D)组、0.5%牛磺酸(T1)组、1%牛磺酸(T2)组和2%牛磺酸(T3)组,牛磺酸处理组分别在饮用水中加入0.5%、1%和2%牛磺酸,对照组正常饮水,持续给予牛磺酸处理8周。8周后进行水迷宫检测各组大鼠空间学习记忆能力,水迷宫检测持续一周。行为学检测后,将动物处死,各组取5只大鼠进行灌流,灌流后进行4%多聚甲醛固定,完整取出大鼠脑组织之后分别放入15%、20%和30%蔗糖溶液进行沉糖,放4度冰箱储存备用。各组其余大鼠直接断头处死,取脑海马组织。将取出的海马组织放于-80度冰箱保存。体外细胞实验,选用海马神经元HT-22细胞进行实验,用高糖(150m M)(HG)进行染毒,之后用10m M、20m M和40m M(T1、T2和T3)进行处理48小时。处理完后收集细胞进行后续实验。运用TUNEL试剂盒和神经元细胞核Neu N免疫荧光染色检测海马神经元凋亡情况;Western blot检测相关蛋白(NGF、Trk A/p-Trk A、Akt/p-Akt、Bad/p-Bad等)的表达水平;体外采用MTT和LDH活性试剂盒检测细胞活性与死亡情况。结果:1.牛磺酸对T2D大鼠空间学习记忆能力的影响水迷宫实验分为两个阶段,前4天的空间学习能力测试和最后一天的空间记忆能力测试。前4天中,相对于Con组大鼠,T2D组大鼠找到目标平台的时间要长,且游泳轨迹杂乱无章,游泳的总路程明显增长(P<0.05)。给予牛磺酸处理的大鼠找到平台时间缩短,同时游泳总路程也减短(P<0.05),这4天的检测中,各组大鼠的游泳速度差异无统计学意义。最后一天的记忆测试,与Con组大鼠相比,T2D组大鼠首次穿越平台所在区域的时间要明显增长(P<0.05)。在90 s的检测中,T2D组大鼠穿越平台所在区域的次数显著减少,而在目标象限所占的时间百分比要少(P<0.05)。而给予牛磺酸处理的大鼠上述指标均显著改善。2.牛磺酸对T2D大鼠海马区神经元凋亡和高糖诱导HT-22细胞凋亡的影响TUNEL和免疫荧光染色显示,T2D组海马CA1区神经元凋亡数量较Con组明显增多(P<0.05),且凋亡关键酶caspase-3活性明显增高(P<0.05)。而给予牛磺酸处理组,海马CA1区神经元凋亡数量与模型组相比显著减少(P<0.05),caspase-3活性降低(P<0.05),体外的细胞实验,150m M葡萄糖能够增加HT-22细胞的凋亡指数,同时使caspase-3的活性增高(P<0.05)。而牛磺酸处理的细胞上述指标均明显改善(P<0.05)。3.牛磺酸对T2D大鼠海马组织和高糖暴露HT-22细胞NGF及其受体的影响Western blot的结果显示,相比于Con组,T2D组海马组织以及高糖培养的HT-22细胞中NGF蛋白表达水平明显降低(P<0.05),p-Trk A的表达水平显著降低(P<0.05),但Trk A的表达水平在各组间差异无统计学意义。牛磺酸处理组大鼠海马以及HT-22细胞中NGF和p-Trk A表达水平明显上升(P<0.05)。细胞实验中加入NGF中和性抗体ab16161(ab)后p-Trk A的表达水平明显降低(P<0.05)。4.牛磺酸对Akt/Bad,线粒体依赖性凋亡信号通路的影响Western bolt的结果显示,Akt,Bad蛋白的表达水平在各组间差异无统计学意义。相比于Con组,T2D组中p-Akt和p-Bad的表达水平明显降低(P<0.05),线粒体中Cyt-C的表达水平降低而胞质中Cyt-C的表达水平显著增高(P<0.05)。牛磺酸处理组,p-Akt和p-Bad的表达水平相比于模型组明显增高(P<0.05),线粒体中Cyt-C表达量增高而胞质中Cyt-C表达量降低(P<0.05)。体外的细胞结果与体内结果相一致。当体外细胞实验加入NGF中和性抗体ab以及Akt拮抗剂Perifosine(P)后,与HG+T组相比,HG+T+ab组NGF表达水平降低,而HG+T+ab和HG+T+P组中p-Akt和p-Bad表达量降低,线粒体中Cyt-C水平降低而胞质中Cyt-C水平升高(P<0.05)。5.牛磺酸通过NGF调控Akt/Bad通路,抑制HG诱导HT-22细胞凋亡TUNEL结果显示,与HG+T组相比,加入ab和P处理组细胞凋亡指数明显升高,caspase-3活性升高(P<0.05)。6.牛磺酸通过调节NGF/Akt/Bad信号通路,抑制HG诱导HT-22细胞凋亡性死亡MTT和LDH结果显示,HG组与Con组相比,细胞活性降低,LDH活性上升(P<0.05),牛磺酸处理组HT-22细胞活性升高,LDH活性降低(P<0.05)。加入ab和P处理后,细胞活性降低,LDH活性增高(P<0.05)。结论:1.牛磺酸改善T2D大鼠认知障碍;2.牛磺酸牛磺酸通过NGF依赖性Akt/Bad通路抑制T2D大鼠海马神经元凋亡。