目的:小细胞肺癌约占肺癌的20%,其恶性程度高、发展迅速、早期可有远处广泛的转移,预后较差。虽然小细胞肺癌对化疗敏感,近期疗效好,但远期容易出现复发和耐药。尽管新一代化疗药物不断面世,抗癌作用进一步增强,但其毒副作用仍不可避免。并且未能完全解决化疗药物的抗药问题,从而限制其临床应用,致使部分患者的存活率未能提高。川芎嗪具有抑制某些实体肿瘤生长、转移的作用,其机制与促进机体免疫功能及诱导细胞调亡有关。顺铂为当前治疗小细胞肺癌最常用的药物之一,具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用、且无交叉耐药等特点。近年来的一些研究表明,某些化疗药物与川芎嗪联合应用,可以提高肿瘤的治疗效果。本试验通过应用川芎嗪与顺铂对接种人小细胞肺癌细胞株NCI-H446裸鼠进行药物作用后,通过测量裸鼠肿瘤体积及肿瘤重量的变化,观察以上药物治疗对瘤体生长情况的影响。同时通过应用川芎嗪与顺铂对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446进行一定的药物影响,观察以上药物作用后对小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡的影响情况。材料与方法:动物实验分为四组:对照组,川芎嗪治疗组,顺铂治疗组,川芎嗪联合顺铂治疗组。各组裸鼠右臀部皮下分别一次性注射约1×10⁷个NCI-H446细胞,液体总量为0.2ml。对照组接种小细胞肺癌细胞后常规饲养动物。各用药组接种后一周开始给药。川芎嗪治疗组给予川芎嗪注射液100 mg/kg腹腔内注射,每天1次,连续21天。顺铂治疗组给予顺铂注射液2mg/kg腹腔内注射,每3天注射一次,连续7次。联合治疗组依前述方法将川芎嗪组和顺铂联合应用。各组裸鼠在治疗结束后5天脱颈法处死,75%酒精中浸泡2～3分钟。取出瘤体,将瘤体移入培养皿中,清除外周血块及结缔组织,用含4万IU/ml青霉素+4万IU/ml链霉素的生理盐水冲洗。用精密天平测量瘤体的重量,并用游标卡尺测量瘤体的长与宽,计算体积。切取各组新鲜瘤块组织,置于4%多聚甲醛固定液中固定72小时后,常规制作石蜡切片,HE染色,光镜下观察,拍照。切取各组新鲜瘤块组织1mm³大小数块,迅速放入4℃预冷的戊二醛和多聚甲醛混合固定液中固定,1%锇酸后固定,环氧树脂包埋,超薄切片用醋酸铀和柠檬酸铅染色,透射电镜观察瘤组织超微结构。人小细胞肺癌细胞株NCI-H446,在含10%胎牛血清的1640完全培养液中37℃和5%CO₂条件下培养,每3天换液一次,并以0.25%的胰蛋白酶消化传代。细胞学实验分成四组:空白组、川芎嗪治疗组、顺铂治疗组及川芎嗪联合顺铂治疗组,分别通过MTT试验、集落形成试验、流式细胞仪检测、RT-PCR和Western blot检测各组NCI-H446细胞增殖、凋亡以及增殖相关基因cyclin D1、P16和凋亡相关基因Bcl-2、p53的改变。结果:1治疗方案结束时,通过精神状态、活动状况、对刺激的反应、体重下降幅度、食欲5项指标的观察,评价裸鼠生存质量和对药物的毒副反应。结果显示:川芎嗪治疗组裸鼠无明显的药物毒副反应,生存质量好;对照组裸鼠也无明显的药物毒副反应,生存质量一般;顺铂治疗组和川芎嗪联合顺铂治疗组药物毒副反应均较重,联合治疗组的毒副反应比顺铂治疗组的毒副反应轻,表明川芎嗪联合顺铂治疗可降低单独应用顺铂治疗的毒副反应。2治疗后观察裸鼠肿瘤的体积:川芎嗪治疗组（14.36±2.54）、顺铂治疗组（12.12±1.57）以及联合治疗组（8.22±3.05）肿瘤的体积小于对照组（15.13±6.38）,差异有显著性（P＜0.05）。裸鼠肿瘤的重量:川芎嗪治疗组（0.0948±0.0328）、顺铂治疗组（0.0496±0.0299）以及联合治疗组（0.0264±0.0257）肿瘤的重量低于对照组（0.1255±0.0412）,差异有显著性（P＜0.05）。联合治疗组裸鼠肿瘤体积减小、重量降低的更加明显（与顺铂治疗组相比P＜0.05）,差异有显著性。3裸鼠瘤块光镜、电镜观察检测瘤体符合小细胞肺癌绌胞特点。光镜结果显示川芎嗪治疗组瘤组织变性坏死,瘤细胞内可见较多脂滴。顺铂治疗组瘤细胞排列疏松,部分细胞体积变小。联合治疗组瘤细胞稀少,体积变小,核固缩,瘤细胞间有结缔组织增生,纤维化明显,可见较多成纤维细胞。透射电镜检查结果显示川芎嗪治疗组瘤细胞脂肪变性多见,细胞浆内脂滴增多,可见较多坏死细胞及其碎片,细胞胞膜不完整,细胞器减少,并且结构不清,呈空泡状。顺铂治疗组瘤细胞分布稀少,且体积明显变小,并可见较多细胞碎片,部分细胞胞浆内线粒体肿胀,细胞核内异染色质增多,肿瘤细胞凋亡现象常见。联合治疗组瘤细胞分布稀少,瘤细胞体积小,组织内细胞碎片多,细胞胞浆内线粒体肿胀,细胞核内异染色质增多,肿瘤细胞凋亡现象更加常见,可见较多凋亡小体形成。4经川芎嗪、顺铂及联合治疗后NCI-H446细胞存活的细胞减少,细胞变圆,坏死。MTT实验显示在72小时及96小时的吸光度值川芎嗪治疗组（1.031±0.034）（1.129±0.049）,顺铂治疗组（0.986±0.028）（1.018±0.038）以及联合治疗组（0.854±0.036）（0.923±0.041）与空白组相比（1.336±0.067）（1.437±0.045）,明显降低（P＜0.05）。提示用药后各组的细胞增殖性降低,且联合治疗组降低的程度最大（与顺铂治疗组相比P＜0.05）,差异有显著性。集落形成实验显示NCI-H446细胞集落形成率川芎嗪治疗组（17.9±3.7）,顺铂治疗组（15.8±3.5）以及联合治疗组（11.2±2.9）与空白组相比（23.8±4.2）,明显减少（P＜0.05）。结果同样显示用药后各组的NCI-H446细胞增殖性下降,且联合治疗组下降的程度最大（与顺铂治疗组相比P＜0.05）,差异有显著性。RT-PCR及Western blot实验结果显示川芎嗪、顺铂以及联合用药后,NCI-H446细胞的增殖性下降的同时P16基因的表达水平升高,cyclin D1的表达水平下降,差异有显著性（P＜0.05）。5经吖啶橙（AO）和嗅乙啶（EB）染色检测细胞凋亡显示川芎嗪治疗组（11.36±2.18）、顺铂治疗组（15.73±3.25）及联合治疗组（21.32±3.27）与空白组比较（5.21±1.94）细胞凋亡率增加,差异有显著性（P＜0.05）,且联合治疗组凋亡率增加最明显（与顺铂治疗组相比P＜0.05）,差异有显著性。流式细胞仪检测细胞凋亡显示川芎嗪治疗组（16.37±1.23）、顺铂治疗组（19.2±1.51）及联合治疗组（21.2±1.79）与空白组比较（5.23±1.01）细胞凋亡率增加,差异有显著性（P＜0.05）,且联合治疗组捌亡率增加最明显（与顺铂治疗组相比P＜0.05）,差异有显著性。DNA电泳显示,除对照组外,其余各组NCI-H446细胞均可引起DNA断裂,两种药物联合应用与单独应用相比DNA损伤程度增加。RT-PCR及western blot实验结果显示川芎嗪、顺铂及联合治疗作用后各组NCI-H446细胞Bcl-2基因的表达水平降低,p53基因的表达水平升高。结论:1川芎嗪、顺铂及联合治疗均可抑制成瘤裸鼠的肿瘤生长。二者联合作用对成瘤裸鼠的肿瘤生长抑制作用强于单独应用顺铂。2川芎嗪单独应用可一定程度提高裸鼠的生活质量,川芎嗪联合顺铂治疗可以降低顺铂的毒副反应。3川芎嗪、顺铂以及二者联合应用均可诱导小细胞肺癌成瘤裸鼠肿瘤细胞凋亡。4川芎嗪、顺铂及联合治疗均可降低小细胞肺癌细胞株NCI-H446的增殖能力。二者联合作用对小细胞肺癌细胞株NCI-H446的增殖抑制作用强于单独应用顺铂。各组小细胞肺癌细胞株NCI-H446增殖能力降低的同时细胞cyclin D1的表达水平降低,P16的表达水平升高。5川芎嗪、顺铂及二者联合应用均可诱导小细胞肺癌细胞株NCI-H446细胞凋亡,二者联合作用对小细胞肺癌细胞株NCI-H446细胞凋亡作用强于单独应用顺铂。诱导NCI-H446细胞凋亡同时其Bcl-2表达水平降低,p53表达水平升高。