论文部分内容阅读
第一部分目的:探讨hepaCAM基因在膀胱移行细胞癌(transitional cellcarcinoma of the bladder,TCCB)中的表达及临床意义。方法:采用RT-PCR方法检测28例正常膀胱对照和34例膀胱移行细胞癌中hepaCAM基因mRNA的表达;分析其与膀胱肿瘤临床参数特征间的关系。结果:hepaCAM基因在TCCB中表达明显低与正常膀胱对照组(p<0.01),且与TCCB分级有关(p<0.05),与临床分期、性别、年龄及复发无关(p>0.05)。结论:hepaCAM基因在TCCB中表达降低或缺失,与膀胱癌发生发展有关,可能是检测膀胱移行细胞癌一种新的辅助诊断指标。第二部分目的:野生型及缺失细胞外结构突变体hepaCAM基因真核表达载体pEGFP-N2-hepaCAM及pEGFP-N2-hepaCAM-mt的鉴定,观察转染后野生型及突变hepaCAM蛋白在T24细胞中定位,获得筛选稳定表达野生型及突变体蛋白的T24细胞的实验方法。方法:野生型及缺失细胞外结构突变体hepaCAM基因的重组真核表达载体pEGFP-N2-hepaCAM及pEGFP-N2-hepaCAM-mt经HindⅢ和Bam HⅠ双酶切及序列鉴定,转染膀胱移行细胞癌T24细胞株,荧光显微镜计算脂质体转染细胞效率,激光共聚焦显微镜观察hepaCAM蛋白及突变体hepaCAM-mt蛋白在T24细胞的定位。G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞,Western blot检测蛋白表达。结果:获得含有野生型hepaCAM及突变体hepaCAM-mt的真核表达载体,建立稳定、高效转染T24细胞的方法。重组质粒转染T24细胞的最佳转染时间为48h,最适合脂质体与质粒的比例为2:1。激光共聚焦显示:单个广泛延展细胞上,hepaCAM蛋白主要定位于核周区域及细胞突起表面;当细胞相互连接时,hepaCAM蛋白形成并指结构显著分布在细胞膜表面相互接触的突起上,呈现典型细胞粘附分子特性。当细胞外区域缺失时,突变体hepaCAM-mt蛋白定位发生了明显改变:在单个细胞中主要集中在细胞核周区域;细胞相互连接时,蛋白非特异性的分布于整个细胞中,而并非集中在细胞相互连接区域。筛选出稳定表达野生型hepaCAM及其突变体蛋白的T24细胞,可以分别有效的表达hepaCAM蛋白及hepaCAM-mt蛋白。检测到hepaCAM蛋白量约为75kDa,而hepaCAM-mt蛋白分子量约为50kDa。结论:重组真核表达载体能够有效的转染T24细胞,从而表达野生型hepaCAM蛋白及突变体hepaCAM-mt蛋白,为下一步研究hepaCAM基因在TCCB中的生物学作用奠定基础。第三部分目的:探讨hepaCAM及突变体hepaCAM-mt基因对T24细胞粘附力、活动力及增殖力影响。方法:通过真核细胞转染技术将含有野生型hepaCAM及突变体hepaCAM-mt的重组质粒分别转染T24细胞,使用G418筛选稳定表达细胞后,采用细胞粘附实验、细胞解离实验探讨hepaCAM基因及突变体对T24细胞粘附力的影响;通过基质胶迁移实验、伤口愈合实验对T24细胞的活动力进行探讨;通过细胞增殖实验对转染后T24细胞的增殖力进行研究,从而对hepaCAM及其突变体基因对T24细胞的生物学影响进行探讨。结果:稳定表达野生型hepaCAM蛋白的T24细胞与表达突变体蛋白的细胞及阴性对照组相比,表现出明显粘附力及活动力增强(p<0.01),并且具有明显抑制T24细胞增殖的能力;转染突变体的T24细胞与转染空白质粒的对照组T24细胞相比,其细胞粘附能力、活动力及抑制细胞增殖的能力都没有表现出明显的差异(p>0.05)。结论:hepaCAM在增强细胞粘附、活动力及抑制细胞增殖方面都具有重要作用,hepaCAM可能是一种新的肿瘤抑制基因;缺乏细胞内区域的突变体hepaCAM-mt基因几乎完全丧失了hepaCAM基因的功能,表明hepaCAM的细胞外区域对其功能的发挥是至关重要的。