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长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)来源的普鲁兰酶(GenBankNo.JN872757.1)在高温、酸性环境条件下有较好的耐受性,满足淀粉工业中糖化过程的要求,可以提高淀粉质原料的利用率,提高工业生产的效率。枯草芽孢杆菌是食品级生产菌株,具有完善的蛋白转录翻译和分泌系统。因此,本研究通过同源重组,将长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因整合在枯草芽孢杆菌基因组中进行表达,构建了分别包含组成型启动子PHpaⅡ和诱导型启动子PsacB的枯草芽孢杆菌表达系统,并对酶活较高的重组菌进行了发酵优化,主要内容如下:(1)从以往构建的穿梭质粒pMA0911-PHpaⅡ-pul中获得普鲁兰酶基因表达框PHpⅡ-pul,构建了枯草芽孢杆菌整合载体pDL-PHpaⅡ-pul,并将普鲁兰酶基因分别整合在B.subtilisWB600和B.subtilisWB800的基因组中实现胞外表达,经过72 h发酵,重组菌B.subtilis WB800-PHpaⅡ-pul(以下简称8H)和B.subtilis WB600-PHpa Ⅱ-pul(以下简称6H)的胞外酶活分别为30.32U·mL-1和18.83U·mL-1。对于包含组成型启动子PHpaH的枯草芽孢杆菌表达系统,选择酶活较高的菌株进行发酵条件的优化,8H在最佳发酵条件下即接种量2%(v·v-1),培养基初始pH7.0,培养温度30℃,摇床转速250r·min-1,酶活最高达到60.85 U·mL-1,约为优化前重组菌8H胞外酶活的2倍;(2)从以往构建的穿梭质粒pMA0911-PsacB-pul中获得普鲁兰酶基因表达框PsacB-pul,并构建了枯草芽孢杆菌整合载体pDL-PsacB-pul,并将普鲁兰酶基因分别整合在B.subtilisWB600和B.subtilis WB800的基因组中实现胞外表达,经过72 h蔗糖诱导,重组菌B.subtilis WB600-PsacB-pul(以下简称6S)和B.subtilis WB800-PsacB-pul(以下简称8S)的胞外普鲁兰酶酶活分别为5.34 U·mL-1和13.19 U·mL-1。对于包含诱导型启动子PsacB的枯草芽孢杆菌表达系统,选择酶活较高的菌株进行蔗糖诱导条件的优化,8S在最佳诱导条件下即蔗糖诱导剂终浓度2%(w·v-1),初始诱导OD600为0.4,诱导温度20℃,酶活最高达到48.59 U·mL-1,约为优化前重组菌8S胞外酶活的3.7倍。