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癌症是一种严重威胁人类健康的慢性致死性疾病。发病隐匿,病情恶化快,预后差。癌症的患病率和死亡率正在逐年升高,癌症治疗的手段也在不断的更新发展中。近年来,过继细胞治疗尤其是嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）疗法在癌症治疗方面取得了显著的成果。CAR-T疗法在体外通过基因工程技术改造T淋巴细胞使其表面表达嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）分子,再将其重新输入病人体内。构建的CAR-T细胞可特异性地识别结合肿瘤相关抗原,激活T细胞从而启动对肿瘤细胞的杀伤。因此与常规免疫细胞治疗相比,它具有更高的靶向性和持久性。大量的临床试验已证实CAR-T在治疗包括急慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤在内的多种肿瘤中疗效显著。然而,细胞因子释放综合征和神经毒性等不良反应严重地影响了 CAR-T治疗的安全性和扩大应用。因此,随着研究的深入,人们越来越关注CAR-T应用中的安全性问题。精确和灵活地控制CAR-T的功能活性成为CAR-T研究的重中之重。利用自杀性开关直接清除CAR-T细胞是常见的提高CAR-T安全性的方法。通过基因工程技术将诱导性Caspase 9（iCasp9）自杀基因系统应用到CAR-T技术中可确保CAR-T治疗的安全性。加入小分子药物AP1903后引起Caspase 9水解酶二聚化进而激活下游Caspase 3促使CAR-T细胞凋亡。因此在CAR-T产生严重不良反应时注射AP1903可直接消除CAR-T细胞中止反应。但AP1903诱导CAR-T发生不可逆地细胞死亡以后,研究者们不得不向病人体内重新输入CAR-T来继续治疗过程。“分离性”CAR-T是一种将CAR分子分为分离的识别域和信号域两部分的正向调控方法。加入小分子Rapalog使两部分重新组装为完整的CAR结构。因此“分离性”CAR-T的活性受Rapalog分子的调控。超声和光等物理手段与特定的调控系统结合也被用于远程非侵入性控制CAR基因的表达。上述方法都存在一定的局限性。探索出一种新颖、迅速且可逆地调控CAR-T活性的工具仍然具有重要意义。不稳定结构域（Destabilizing domain,DD）及其小分子配体组成的不稳定结构域系统是近期报道的一种胞内蛋白调控工具。目前已报道的不稳定结构域主要由 FK506 与雷帕霉素结合蛋白（the FK506-and rapamycin-binding protein,FKBP12）、大肠杆菌二氢叶酸还原酶（Escherichia coli dihydrofolate reductases,ecDHFR）、人雌激素受体配体结合结构域（Human estrogen receptor ligand binding domain,ERLBD）和鳗鱼荧光蛋白（UnaG）衍生而来。不稳定结构域与目的蛋白（Protein of interest,POI）构成的融合蛋白的稳定性受DD配体调控。在配体不存在时,融合蛋白因不稳定结构域的内在不稳定性被降解,但当配体存在时,融合蛋白稳定存在不会被降解。研究发现该系统能够以快速、可逆、配体浓度依赖的方式调控融合蛋白的表达,并已证实在人体细胞内正常起效。CAR分子虽然是一种特殊的人工合成分子,但它的本质是膜蛋白。所以,有理由认为DD系统可用于控制CAR-T细胞。在本研究中,我们依据大肠杆菌二氢叶酸还原酶衍生不稳定结构域（the DD derived from Escherichia coli dihydrofolate reductases,DHFR）及其配体甲氧苄啶（Trimethoprim,TMP）设计了一种控制CAR-T活性的新方法。基因工程改造的CAR-DD可在蛋白水平调控CAR分子膜上积累量,进而影响CAR-T的功能。研究目的1.构建CD19-CAR-DHFR质粒,获得CD19-CAR-DHFR-T细胞;2.细胞实验验证不稳定结构域系统对CAR分子表达及CAR-T功能的调控;3.动物实验验证不稳定结构域系统对CAR-T体内抗肿瘤作用的调控。研究方法1.EGFP-DHFR-T/CD19-CAR-DHFR-T细胞的构建目的基因片段的合成、EGFP-DHFR/CD19-CAR/CD19-CAR-DHFR质粒的构建、慢病毒包装及感染T淋巴细胞。2.细胞实验:（1）TMP调节EGFP-DHFR融合蛋白表达水平检测:将DHFR结合到增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）的 C 端,通过 TMP浓度增加和TMP去除等试验检测DHFR系统在人原代T淋巴细胞的应用可能。并增加TMP处理时间检测该系统的长期稳定性。（2）TMP调节CAR-DHFR融合蛋白表达水平检测:CARt-EGFP-DHFR质粒构建及转染293FT细胞。转染的细胞接受不同状态的TMP处理。共聚焦显微镜观察细胞表面EGFP发光程度,微孔板分析仪检测荧光强度。（3）TMP调节CAR-DHFR-T细胞体外杀伤功能检测:将CD19-CAR-DHFR-T与Raji细胞共孵育,经不同浓度状态的TMP处理24h后,萤火虫荧光素酶法检测杀伤效率。（4）CAR-DHFR-T细胞体外杀伤特异性检测:将CD19-CAR-DHFR-T与CD19抗原阳性的Raji细胞及CD19抗原阴性的K562细胞分别孵育,经TMP处理24h后,检测比较杀伤效率。（5）TMP调节CAR-DHFR-T细胞体外分泌细胞因子IFN-γ检测:将效应细胞与靶细胞在不同浓度的TMP中共孵育24h后,ELISA检测上清液中细胞因子IFN-γ的分泌水平。（6）DHFR结构域对CAR-T细胞状态影响检测:通过流式细胞术和连续细胞计数检测比较CD19-CAR-T与CD19-CAR-DHFR-T细胞增殖及凋亡的区别;（7）小分子配体TMP对T细胞状态影响检测:流式细胞术和连续细胞计数法检测TMP的有无对T细胞增殖和凋亡的影响。3.动物实验:（1）CD19-CAR-DHFR-T体内抗肿瘤作用受TMP调节检测:构建小鼠B细胞淋巴瘤模型。尾静脉注射UDT/CD19-CAR-T/CD19-CAR-DHFR-T细胞。每天在饮水中加入TMP或佐剂。每周进行小动物成像,观察各组小鼠精神状态,记录小鼠死亡时间,绘制生存曲线。（2）低剂量TMP调控CD19-CAR-DHFR-T抗肿瘤效应检测:构建小鼠B细胞淋巴瘤模型。在接受CD19-CAR-DHFR-T的小鼠中增加TMP低剂量组。定期小动物成像检测肿瘤进展情况。4.统计学分析:使用Student’st检验来分析数据间差异。本研究默认P<0.05为差异具有统计学意义。生存曲线差异使用log-rank检验。细胞实验均重复至少3次。研究结果1.可调控EGFP-DHFR-T/CAR-DHFR-T细胞的构建（1）构建了EGFP-DHFR,CD19-CAR以及CD19-CAR-DHFR等质粒。（2）EGFP-DHFR,CD19-CAR 以及 CD19-CAR-DHFR 包装成慢病毒且感染T淋巴细胞,转染率在50%以上。2.体外实验验证不稳定结构域系统对CAR分子表达及CAR-DHFR-T功能的调控（1）小分子配体TMP控制CD19-CAR与DHFR构成的融合蛋白膜上累积水平。（2）TMP可调节CD19-CAR-DHFR-T细胞分泌的细胞因子水平及体外细胞毒性。而DHFR结构域的插入对CD19-CAR分子识别的特异性及正常功能无影响。（3）DHFR结构域的插入对CAR-T的增殖和杀伤没有明显的影响。（4）TMP对T淋巴细胞增殖和杀伤亦没有明显的副作用。3.体内实验验证不稳定结构域系统对CAR-DHFR-T的体内抗肿瘤作用的调控。结论基于DHFR和TMP构建的CAR-DD技术为条件性控制地CAR-T细胞提供了一种简便有效的通用方法,在开发更安全、更精确的细胞治疗产品方面具有巨大的应用潜力。