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α-蒎烯是一种典型的挥发性有机化合物(Volatile Organic Compounds,VOCs),对环境以及人体自身健康都具有较大影响。降解α-蒎烯的有效方法之一就是利用微生物降解技术。结合分子生物学技术,可以鉴定出参与污染物代谢的特定关键基因,并试图通过紫外诱变、转座子插入等手段,失活关键基因,调控代谢流,实现目标产物枯茗酸的大量积累,从而为了解微生物代谢过程及废物资源化奠定基础。本研究所用的α-蒎烯高效降解菌Pseudomonas veronii ZW,由实验室早期分离筛选获得。通过运用传统生物学并结合现代分子生物学技术,对菌株ZW在α-蒎烯诱导下的代谢机理开展了研究,并利用诱变技术对菌株进行了定向改造,实现了关键中间代谢产物枯茗酸的积累。通过GC-MS检测到菌株ZW降解α-蒎烯的中间产物——枯茗酸,结合实验室已获得的结果和文献,完善了菌株ZW降解α-蒎烯的代谢途径:α-蒎烯转化为伞花烃,伞花烃转化为4-异丙基苯甲醇和3-羟基-4-异丙基甲苯。其中,4-异丙基苯甲醇转化为4-异丙基苯甲醛(即枯茗醛),枯茗醛转化为4-异丙基苯甲酸(即枯茗酸),最终形成2-甲基-1,4丁二酸和乙二酸和乙酸等小分子有机酸类物质,进入TAC循环。通过对供试菌株ZW进行紫外诱变获得一株丧失氨苄青霉素抗性的诱变菌株ZW-3,其形态和降解特性与正常菌株ZW基本保持一致,在36 h能对100 mg/L的α-蒎烯去除率都能达到100%。该诱变株的获得为后续转座子实验提供受体菌株。利用转座子技术和双亲结合的方法对诱变株ZW-3实施了诱变,获得大量转座子诱变突变株,从中筛选到一株突变株ZW-A,它能够降解α-蒎烯,并实现中间产物枯茗酸的积累。该诱变株对100 mg/L的α-蒎烯降解率为80%,枯茗酸的积累率为20%。通过SEFA-PCR技术成功克隆出由于转座子插入使得受体菌株ZW-3体内失活的基因片段。PCR出的基因片段含有4个完整的开放阅读框,中orfA与rulAB的同源性较高,有报道称rulAB蛋白参与了芳香族化合物的降解,所以orfA即为与降解枯茗酸相关的基因序列。通过对无机盐筛选发现,添加硫酸镁会促进诱变株的生长。确定了最佳硫酸镁添加浓度为0.307 mg/L,在该条件下,突变株ZW-A对100 mg/L的α-蒎烯的降解效率为85%,枯茗酸的积累率由20%上升到24.5%。