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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome PRRS),又称猪蓝耳病,在世界范围内广泛流行,困扰全球养猪业的持续健康发展。PRRS病毒(PRRSV)感染猪后导致炎症调节失衡,一方面在感染早期炎症因子的表达被抑制,另一方面在感染晚期炎症因子大量表达,形成“炎症因子”风暴,这也是PRRSV导致感染猪死亡的重要因素之一。炎症反应是十分复杂的调节网络,涉及模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs)、接头蛋白、激酶、转录因子、促炎细胞因子等,同时还涉及各种蛋白质翻译后修饰,如泛素化和磷酸化。其中炎症相关转录因子NF-κB在炎症调控网络中扮演着非常重要的作用。目前,识别PRRSV的模式识别受体及其下游信号转导的细节尚未明确,PRRSV抑制早期炎症反应的作用靶点和具体机制也不清楚。本文首先分析了 Nucleotide-binding oligomerization domains (NOD)-like receptors(NLRs)和DExD/H-box helicase两类模式识别受体在PRRSV感染晚期激活NF-κB中的作用,随后筛选了抑制NF-κB激活的PRRSV编码蛋白并探讨了其作用机制。从模式识别受体、接头蛋白和线性泛素化修饰等层面,初步揭示了 PRRSV调控炎症相关NF-κB信号转导的机制,主要研究内容和结果如下:1. PRRSV通过NOD2激活NF-κB信号转导的机制通过real-time RT-PCR检测PRRSV感染MARC-145细胞后,部分NLRs家族蛋白mRNA的表达情况。发现NOD1、NOD2和NLRP3的表达上调达到5倍左右。Western blot实验发现在蛋白水平上,PRRSV感染上调NOD2和NOD2通路接头蛋白 receptor-interacting protein 2 (RIP2)表达。阳性刺激物 muramyl dipeptide (MDP)能够激活RIP2磷酸化,而不能上调RIP2表达。而PRRSV感染不仅上调RIP2表达,也能诱导RIP2磷酸化。进一步采用RNA干扰技术,下调NOD2或RIP2表达,发现MDP和PRRSV诱导的NF-κB启动子激活,P65磷酸化以及MAPK通路的P38,JNK和ERK磷酸化水平均受不同程度的抑制,PRRSV诱导的炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES的表达量也显著下调。上述研究结果表明PRRSV可以通过NOD2激活NF-κB信号转导。2. DHX36识别N蛋白,激活NF-κB信号转导的机制DExD/H helicases是一类高度保守的ATP依赖的解旋酶,研究表明该家族的部分成员,如DHX36,能够识别病毒,激活天然免疫。为了研究DHX36在PRRSV感染中的作用,首先通过Western blot检测PRRSV感染细胞后DHX36的表达,发现DHX36的表达量在PRRSV感染24h以后显著上调。间接免疫荧光实验发现在未感染PRRSV时,大部分DHX36在细胞浆和细胞核弥散分布,但PRRSV导致DHX36从细胞核向细胞浆转运,呈明显的细胞浆分布。通过NF-κB启动子双荧光素酶实验发现,干扰DHX36表达后,PRRSV诱导的NF-κB启动子激活,IκB降解和P65磷酸化以及IL-6, IL-8,TNF-α和RANTES等炎症因子的mRNA表达水平均受到明显抑制。上述研究结果表明DHX36在PRRSV诱导NF-κB激活中扮演重要作用。前期研究表明PRRSV编码的核衣壳蛋白(N)能激活NF-κB,但其作用机制不清楚。通过双荧光素酶实验,发现干扰内源性的DHX36之后,N蛋白诱导NF-κB激活被显著抑制,而超表达DHX36显著促进N蛋白诱导的NF-κB激活,表明DHX36参与N蛋白诱导的NF-κB激活。免疫共沉淀(Co-IP)实验进一步显示DHX36和N蛋白存在相互作用。3. PRRSVnsp1α蛋白通过靶向LUBAC抑制NF-κB信号转导的机制linear ubiquitin chain assembly complex (LUBAC)由催化亚基 HOIP 和结合亚基HOIL-1L及SHARPIN组成。其介导的NEMO分子线性泛素化修饰是NF-κB激活所必须的。首先通过双荧光素酶报告实验发现,PRRSV感染后10-20h抑制LUBAC超表达诱导的NF-κB启动子活性。LUBAC超表达能够显著诱导IκB降解和P65磷酸化,而PRRSV感染后,IκB降解和P65磷酸化受到明显抑制。进一步通过双荧光素酶筛选发现nsp1α能够抑制LUBAC信号转导。构建了 nsp1α结构域缺失突变体,结果显示超表达nsp1αAN能够抑制LUBAC,而nsp1αAC失去抑制功能。Co-IP实验显示nsp1α与LUBAC复合体中的HOIP和HOIL-1L发生互作,竞争性抑制HOIP-SHARPIN之间的互作,表明PRRSVnsp1α能够通过靶向LUBAC抑制NF-κB信号转导。