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目的:经典的mi RNA的作用及其机制已被广泛研究和认同,但最近发现有一类mi RNA不依赖Drosha加工形成(即非经典mi RNA),其功能却鲜有报道。本研究拟探究非经典的、Drosha非依赖性mirtron类mi R-4646-5p在胃癌脂质代谢改变及胃癌转移中的作用及其分子机制。方法:(1)采用mi RNA芯片分析Drosha沉默的胃癌细胞中mi RNAs的表达差异;生物信息分析异常上调的mi RNAs,筛选出13个潜在的、Drosha非依赖性mirtrons,q RT-PCR验证芯片中3个经典mi RNAs和13个潜在mirtrons的表达,挑选出显著上调的mirtron类mi RNA-4646-5p作为研究目标,并在其它Drosha沉默的胃癌细胞中验证其表达的改变;进一步利用star BASE和TCGA STAD数据以及收集的临床胃癌样本,验证mi RNA-4646-5p在胃癌患者肿瘤样本中的表达,以及mi RNA-4646-5p在胃癌转移与非转移患者中表达的差异,探究其表达与胃癌患者转移、预后和生存的关系;通过体外Transwell实验和体内构建裸鼠胃癌肝肺转移模型,探究胃癌野生型细胞中过表达mi RNA-4646-5p、Drosha沉默的胃癌细胞中敲低mi RNA-4646-5p以及胃癌野生型细胞中敲低mi RNA-4646-5p的表达对胃癌细胞侵袭转移能力的影响。(2)利用UCSC数据库探究mi RNA-4646-5p与宿主基因Abhd16a的基因结构关系,并采用内含子突变实验验证mi RNA-4646-5p是由其宿主基因Abhd16a的第3号内含子特异性剪接形成,进一步采用q RT-PCR和Western Blot探究宿主基因Abhd16a在Drosha沉默的胃癌细胞中表达的改变;利用Human Splicing Finder在线工具分析宿主基因Abhd16a第3号内含子上潜在剪接因子SRSF1、SRSF2和SRSF5的剪接位点,q RT-PCR验证3个剪接因子在Drosha沉默的胃癌细胞中的表达,并挑选出异常上调的剪接因子SRSF2;进一步在Drosha沉默的胃癌细胞中敲低SRSF2,q RT-PCR检测mi RNA-4646-5p表达的改变;利用收集的胃癌患者肿瘤样本,评估Drosha、SRSF2、ABHD16A和mi R-4646-5p的临床相关性。(3)利用mi RDB和Target Scan数据库预测mi RNA-4646-5p的潜在靶基因,并与Drosha沉默的基因芯片中下调基因进行比对,筛选出5个潜在靶基因PHD3、LRG1、EPHA3、SMAD9和COL23A1,q RT-PCR检测潜在靶基因在Drosha敲低的胃癌细胞以及mi RNA-4646-5p过表达或敲低的胃癌细胞中表达的改变,并挑选出差异变化最明显的靶基因PHD3;进一步用荧光素酶报告实验验证mi RNA-4646-5p和靶基因PHD3的关系;利用IP-WB或蛋白酶抑制剂,探究mi R-4646-5p及靶基因PHD3对HIF1A泛素化水平的影响;生物信息分析、CHIP和双荧光素酶报告实验验证HIF1A作为转录因子对宿主基因Abhd16a的调控作用,进一步在胃癌细胞中过表达HIF1A,q RT-PCR检测宿主基因Abhd16a和mi RNA-4646-5p表达的改变。(4)利用TCGA数据库,评估ABHD16A的表达与胃癌患者不良预后和转移的关系;构建ABHD16A过表达、Drosha和ABHD16A同时敲低的胃癌细胞株,Western blotting验证ABHD16A敲低或过表达效率;进一步采用Transwell实验,探究ABHD16A敲低或过表达对胃癌细胞侵袭能力的影响;利用LC/MS-MS进行脂质代谢组学分析,探究ABHD16A及mi RNA-4646-5p介导的脂质代谢及代谢产物的变化,并挑选出异常累积的溶血磷脂酰丝氨酸(lyso-PS);在胃癌细胞中外源性添加lyso-PS,Transwell检测胃癌细胞侵袭能力的变化;并在体内利用小鼠肝肺转移模型,探究ABHD16A过表达、敲低以及敲低后回补lyso-PS对胃癌细胞侵袭能力的影响。(5)采用RNA-Seq及通路富集分析,检测外源性lyso-PS处理胃癌细胞后下游通路的改变;RT-PCR检测人胃癌细胞中lyso-PS三个特异性孤儿受体GPR34、P2Y10和GPR174的表达;利用效应蛋白Rhotekin的Rho结合域(RBD)作为探针,特异性检测mi R-4646-5p/ABHD16A/lyso-PS/GPR34/Gi改变对Rho A活性的影响;CHIP和双荧光素酶实验检测HIF1A对Rho A的表达调控关系,Western blotting检测mi R-4646-5p/PHD3/HIF1A对Rho A表达的影响;进一步利用WB和Transwell实验探究mi R-4646-5p/ABHD16A/lyso-PS/GPR34引起的Rho A活性改变和mi R-4646-5p/PHD3/HIF1A介导的Rho A表达改变,对下游LIMK/cofilin磷酸化过程以及胃癌细胞侵袭能力的影响;WB验证小鼠体内肝肺转移组织中下游通路Rho A/LIMK/cofilin的改变,以及代谢检测lyso-PS水平的变化;利用TCGA胃癌数据,GSEA富集mi R-4646-5p或ABHD16A过表达下游通路的变化;q RT-PCR检测胃癌转移患者中下游重要分子GPR34和Rho A的表达;免疫组化验证胃癌转移与非转移患者组织样本中重要分子ABHD16A/GPR34/HIF1A/Rho A/p-LIMK/p-cofilin的表达。结果:(1)Drosha沉默的胃癌细胞中存在异常高表达的非经典mirtron类mi RNAs,其中mi R-4646-5p表达上调最为显著;mirtron类mi R-4646-5p在胃癌中高表达,与胃癌不良预后和转移有关;mi R-4646-5p在体内、体外促进了胃癌细胞侵袭和转移。(2)mi R-4646-5p是5’尾mirtron,由其宿主基因Abhd16a第3号内含子特异性剪接形成;在Drosha敲低的胃癌细胞中,Abhd16a的m RNA和蛋白水平也显著上调;同时,剪接因子SRSF2在胃癌Drosha沉默的细胞中表达上调,高水平的剪接因子SRSF2促进了宿主基因Abhd16a第3号内含子的特异性剪接,从而导致胃癌中mirtron类mi R-4646-5p表达上调。(3)PHD3是mi R-4646-5p的直接靶基因,在Drosha沉默的胃癌细胞中表达下调;mi R-4646-5p可以通过抑制靶基因PHD3,进而抑制HIF1A泛素化降解,导致Drosha敲低的胃癌细胞中的HIF1A表达上调;WB显示ABHD16A的表达和HIF1A有相同的变化趋势;HIF1A可作为宿主基因Abhd16a的转录因子,上调Abhd16a及mi R-4646-5p的表达。(4)ABHD16A在胃癌中高表达,与胃癌患者不良预后和转移有关,体外实验显示胃癌细胞中ABHD16A过表达促进了胃癌细胞侵袭转移;代谢组学结果显示,ABHD16A作为一种新型脂肪酶,参与了胃癌脂质代谢,引起下游代谢产物lyso-PS异常积累;体外、体内实验显示,mi R-4646-5p/ABHD16A介导的lyso-PS积累促进了胃癌细胞侵袭转移。(5)RNA-Seq结果显示,GPCR配体结合通路、Gi信号通路、Rho蛋白信号转导通路以及细胞转移相关信号通路等在lyso-PS处理后显著富集;胃癌细胞中mi R-4646-5p/PHD3/HIF1A轴可上调Rho A的表达,mi R-4646-5p/ABHD16A介导的脂质代谢物lyso-PS积累,则可激活Rho A活性;Rho A活性和表达的改变通过影响下游LIMK/cofilin磷酸化水平,在体外促进胃癌细胞侵袭转移;体内实验显示,小鼠肝肺转移组织中lyso-PS的水平显著升高,下游信号通路Rho A/LIMK/cofilin也被激活;临床胃癌患者数据显示,mi R-4646-5p或ABHD16A过表达与Rho-GTPase和细胞骨架相关信号通路呈正相关;ABHD16A、HIF1A、Rho A、GPR34以及磷酸化LIMK和cofilin在转移性胃肿瘤组织中表达上调。结论:(1)胃癌中存在Drosha非依赖的mi R-4646-5p异常高表达,且与胃癌转移和不良预后有关。(2)mi R-4646-5p属于Drosha非依赖性5’尾mirtron,由宿主基因Abhd16a第3号内含子特异剪切形成,高表达的剪接因子SRSF2促进了mi R-4646-5p的剪接。(3)mi R-4646-5p通过靶向PHD3稳定了HIF1A,正反馈促进了宿主基因Abhd16a和mi R-4646-5p本身的表达。(4)mi R-4646-5p通过调控新型脂肪酶ABHD16A引起下游脂质代谢产物lyso-PS异常累积,促进胃癌细胞转移。(5)mi R-4646-5p/PHD3/HIF1A介导的Rho A表达上调,协同mi R-4646-5p/ABHD16A/lyso-PS/GPR34介导的Rho A激活,通过触发LIMK/cofilin磷酸化信号,在体内体外促进了胃癌转移。