糖尿病是由不同发病机制和病因引起的体内胰岛素绝对或相对不足,从而导致糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱,并以严重高血糖为主要临床表现的代谢性疾病。尽管现代医疗技术已在糖尿病的诊断和治疗中取得了很大进步,但糖尿病及其并发症的发病率在世界范围内仍然仅次于心脑血管疾病和肿瘤。随着国民生活水平的提高,糖尿病的发病率也呈现上升趋势。流行病学调查显示,2017年全球糖尿病患者人数为4.25亿,预计到2045年将突破6.29亿。仅在中国,20-79岁的成人糖尿病患者就有1.14亿,位居世界第一。糖尿病引发的心脑血管疾病是导致患者死亡的主要原因,因此对糖尿病的早期诊断、病程监测及其干预治疗显得十分重要。糖尿病患者血液中葡萄糖浓度的异常升高使得人体内蛋白质在没有糖基转移酶参与的情况下与葡萄糖发生一种名为非酶糖基化的反应,此反应是引起糖尿病以及相关并发症的始动因素。人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是血浆中的高丰度蛋白,主要负责结合及运输各类药物,对多种药物的药代动力学特性及药效发挥有着深远影响。糖尿病患者的高血糖使HSA发生非酶糖基化的概率比其它蛋白高,较高水平的非酶糖基化修饰不仅会导致HSA结构和功能发生改变,而且对于机体的正常生理活动也将产生严重的影响。HSA上多个非酶糖基化位点在其三维结构上的不同分布,使得它们在不同葡萄糖浓度水平下发生非酶糖基化的程度也有所差异。位于主要药物结合区域位点的非酶糖基化修饰,将显著影响此区域结合药物的能力,从而影响药物的药代动力学特性和药效。糖尿病患者心脑血管疾病的发生率远远高于正常人群,因此使用抗凝药物的几率也大于非糖尿病患者。华法林和肝素是临床抗凝治疗中常用的两种抗凝药,如果使用不当则会引起严重的出血等副反应,因此需要严格检测相关指标。为了解糖尿病患者中HSA非酶糖基化对这两种抗凝药物的结合、运输及药效变化影响,我们有必要从早期HSA非酶糖基化产物入手,通过对其非酶糖基化位点的定性、定量以及功能变化研究,了解HSA非酶糖基化在临床抗凝给药治疗中的作用及意义。本论文利用液相色谱与质谱联用技术,定性和定量分析了健康受试者与糖尿病患者的血浆样本中HSA非酶糖基化位点。同时在体外和体内分别研究了 HSA的非酶糖基化对抗凝药物(华法林和肝素)的结合、药代动力学特性及药效的影响。以计算机模拟对接结合氨基酸突变技术为辅助工具,了解特定位点的非酶糖基化对整个HSA结合药物的影响。本论文更加全面地鉴定了 HSA的非酶糖基化位点,并将同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术与三级质谱相结合,建立了准确而又高通量的非酶糖基化位点定量方法。随后在体外和体内均证明糖尿病HSA非酶糖基化对华法林的药效改变产生影响。本论文研究成果,有助于加深我们对糖尿病及其并发症的发病机理了解,并且为糖尿病的临床早期诊断与指导用药提供有力的理论依据。本论文的主要研究成果如下:1.定性比较糖尿病及健康受试者血浆中HSA非酶糖基化位点应用纳升液相色谱与多级质谱联用技术(nano-liquid chromatography multi-stage mass spectrometry,nLC-MSn)的高效分离效果与高分辨率,对健康组与糖尿病组HSA非酶糖基化位点进行定性分析。共鉴定到49个HSA非酶糖基化位点,其中7个位点为首次鉴定。健康组和糖尿病组分别鉴定到40和47个非酶糖基化修饰位点。相比于健康组,糖尿病组非酶糖基化位点数目较多,这与糖尿病患者的高血糖有必然联系。通过探讨HSA非酶糖基化位点在其三维结构上的分布,发现大部分位点均分布在HSA三维结构表面,并且靠近于碱性氨基酸。本论文中鉴定到的非酶糖基化位点,较目前报道的位点更全面,丰富了对现有体内非酶糖基化位点的报道,并扩展了我们对糖尿病及其并发症发生发展的进一步认识。2.定量比较糖尿病及健康受试者血浆中HSA的非酶糖基化位点应用iTRAQ标记技术的高通量,结合纳升液相色谱与三级质谱联用技术(nLC-MS3)的高分辨率和高准确度,对健康组与糖尿病组HSA非酶糖基化位点进行定量分析。该部分首次将iTRAQ标记技术、硼酸盐亲和色谱和三级质谱法相结合,建立了一种新的非酶糖基化肽段定量方法。共定量到21个非酶糖基化位点,其中19个位点在糖尿病组与健康组之间具有显著性差异(p<0.05)。7个位点位于HSA主要药物结合区域Subdomains ⅡA和ⅢA,因此推测这些位点在糖尿病患者体内的异常非酶糖基化,将导致HSA药物结合功能改变。K199肽段的非酶糖基化变化程度最为显著(p<0.01),进一步采用高灵敏的nLC-MS/MS-多反应监测模式(multiple reaction monitoring,MRM)验证后,发现其非酶糖基化变化趋势与iTRAQ-nLC-MS3中的一致,且仍具有极显著差异(p<0.0001)。进一步说明K199对血糖浓度的变化比其它位点更敏感,故糖化K199肽段可作为临床糖尿病诊断的候选预警标志物。从空间分布看,位点K199不仅位于药物结合区域Subdomains ⅡA,而且临近于Subdomains ⅢA,因此K199的非酶糖基化可能对糖尿病患者的药物转运和疗效有重要影响,这为研究糖尿病HSA药物运输功能的改变提供进一步研究方向。3.K199非酶糖基化修饰对HSA结合抗凝药物的影响以定量结果中差异最显著的位点K199为主要研究对象,采用模拟对接技术研究了 K199非酶糖基化对HSA结合抗凝药华法林和肝素的影响。结果表明K199非酶糖基化对于华法林的亲和力增加了近两倍,而对于肝素结合并没有显著影响。考虑到除K199外,其他位于或者靠近HSA药物结合区域位点的非酶糖基化也会影响华法林的结合。我们将模拟对接技术与nLC-MS/MS-MRM定量技术相结合,比较了位于或靠近于药物结合区域位点的非酶糖基化对华法林结合的贡献,发现K199的非酶糖基化是引起华法林结合改变的主要原因。PCR突变技术被用来进一步验证K199位点的非酶糖基化对华法林结合的影响,结果表明HSA(K199M)是否发生糖化对华法林的结合并无显著影响。原因是HSA(K199M)的K199位点突变为M后,此位点将不会发生非酶糖基化修饰,而HSA(K199M)上除K199外其他位点的非酶糖基化修饰对华法林的结合影响不大。相反,位点K199非酶糖基化对糖尿病患者与华法林结合亲和力的增加贡献最大。本章证明了 K199非酶糖基化在HSA结合不同抗凝药中的作用,为研究非酶糖基化对糖尿病患者体内抗凝药物分配的影响提供了理论指导。4.HSA非酶糖基化对抗凝药物结合和运输的影响采用超滤与LC-MS/MS-MRM技术相结合,体外和体内研究了 HSA非酶糖基化对华法林和依诺肝素钠结合的影响。首次建立了基于超滤和2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone,AMAC)标记技术的肝素类多糖药物在血浆中的分析方法。将糖尿病与健康受试者新鲜血浆分别与抗凝药物华法林和依诺肝素钠进行体外孵育,测定游离药物浓度。糖尿病患者血浆中游离华法林浓度相对于健康组明显减少(p<0.005),而对于游离依诺肝素钠则没有显著性差异(p=0.17)。说明糖尿病中非酶糖基化HSA对华法林的结合作用增强,而对依诺肝素的结合没有影响。为在体内验证以上结果,选择模型糖尿病大鼠进行给药,通过测定血浆中各时间点游离华法林与依诺肝素钠浓度,比较两种抗凝药在正常和糖尿病大鼠中的药代动力学特性变化。结果表明华法林在糖尿病大鼠体内的游离药物浓度曲线不同于正常大鼠,在给药8小时后游离华法林浓度明显低于正常组。相比之下,依诺肝素钠在两组之间并没有显著性差异。进一步证实了糖尿病患者体内非酶糖基化白蛋白与华法林结合增强,导致游离华法林的量减少。在药物药效发挥过程中只有游离药物分子具有药理学作用,因此HSA对药物分子的结合力将决定游离药物分子水平,进而影响药效。考虑到心脑血管疾病在糖尿病患者中的高发性,华法林在临床上糖尿病患者的抗凝药效也可能受到影响。本实验研究结果将为糖尿病合并心脑血管疾病患者的临床抗凝药物选择提供一定的参考,并对华法林给药治疗的药效变化进行了预估。此外,本实验建立的血浆中的依诺肝素钠分析方法,将为分析动物疾病模型或临床样本中的多糖药物提供有价值的参考。5.糖尿病患者抗凝药物疗效的初步临床回顾性研究为评估非酶糖基化修饰对糖尿病患者抗凝药物的疗效影响,进行了一项包括53名受试者的初步临床回顾性研究。对使用华法林和肝素的糖尿病和非糖尿病患者进行比较,发现糖尿病患者服用华法林后24 h的国际标准化比值(international normalized ratio,INR)和服用前后INR差值均显著小于非糖尿病患者(p<0.05),而使用肝素后的INR 24 h与INR差值均与非糖尿病患者之间无显著性差异(p>0.05)。服用华法林后糖尿病患者INR值降低,说明糖尿病患者的血浆中游离华法林浓度降低进而降低药效,使糖尿病患者更容易凝血。加之糖尿病患者本身处于高凝状态,因此服用华法林需要时刻调整和密切关注INR值。此外,结合华法林对糖尿病和非糖尿病大鼠的药代动力学行为差异的事实,临床上对心脑血管疾病合并糖尿病患者使用华法林作为抗凝药物时必须格外谨慎。从糖尿病患者和非糖尿病患者的药物等效性来说,肝素相对于华法林更安全有效。本实验为糖尿病患者使用特定抗凝药物治疗的安全与风险做出了评估,同时为临床糖尿病抗凝药指导用药提供了参考价值。