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研究背景和目的人类主要组织相容性复合体Ⅰ相关基因A (MICA)在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用。越来越多的临床研究表明,肾移植受者血清中抗MICA抗体的含量与移植后急性和慢性排斥反应发生率密切相关,但目前其激活和作用机制仍不清楚。有研究发现,缺血再灌注(I/R)损伤可以上调小鼠肾脏中MICA表达,而低氧诱导因子-1(HIF-1)表达增加作为缺血早期首发的分子水平适应性反应,能通过调控下游系列基因表达,介导与缺氧相关的各种生理性反应。有研究发现人原代心肌细胞中,HIF-la过表达能上调MICA表达。因此推测人肾小管上皮细胞也可能存在类似激活作用机制。因此,本研究的目的在于初步探讨人肾小管上皮细胞中HIF-la过表达是否可增强细胞MICA基因表达。方法1.进行肾小管上皮细胞系培养,摸索建立体外缺血再灌注模型,确定在2%氧浓度下缺氧18h后正常供氧。2.进行重组腺病毒的扩增、纯化,采用组织培养感染剂量法(tissue culture infections dose, TCID法)进行病毒滴度的测定。3.转染在常氧下可以稳定表达并发挥正常功能的HIF-1α重组腺病毒(Ad.CMV.HIF-1α△ODD),在转染的24、28、72、96h后用TRIZOL提取HK-2的总RNA并进行反转录PCR。采用标准曲线法,以B-ACTIN作为内参因,通过荧光定量PCR检测HIF-la、 HO-1、 VEGF和MICA的基因转录水平。在腺病毒转染的96h用免疫荧光的方法检测目的基因HIF-1a在HK-2中蛋白水平的表达情况。4.体外用缺氧再给氧(H/R)模型模拟I/R,HIF-la基因沉默后,将经过RNAi处理过的细胞在2%氧浓度下培养18h进行缺氧后,在缺氧再给氧的Oh、4h、8h和16h收集细胞。用TRIZOI法提取HK-2细胞的总RNA并进行反转录PCR。同时以基因β-ACTIN作为内参,通过荧光定量的方法检测HIF-1a和MICA基因的转录水平。5.实验数据均用均数±标准差(x±S)来表示。两组均数间的比较采用t检验,使用SPSS13.0统计软件进行计算,P<0.05认为有显著性差异。结果1.在常氧条件下,HIF-1a的过表达可以上调细胞MICA基因蛋白的表达。Ad.CMV.HIF-1a△ODD组和Ad.CMV.HIF-la组的HIF-lamRNA水平从转染的24h后就开始升高,在72h达到高峰,96h有略微的下降；并且两组间mRNA水平差异不大,在HIF-la基因的转录水平上表达相似。而Ad.CMV.LacZ组和非转基因组的HIF-la mRNA水平相比前两组一直保持很低水平,并且基本无变化。免疫荧光结果显示,在转染的96h后,Ad.CMV.HIF-la△ODD组的HIF-1a蛋白的表达较正常组显著增加,而Ad.CMV.HIF-1a组中仅检测到少量HIF-1a的表达；而Ad.CMV.LacZ组和非转基因组中均未检测到HIF-la蛋白的表达,提示在常氧状态下,改造后的HIF-la△ODD较HIF-la的蛋白表达更为稳定,不受氧依赖性的降解。2.常氧状态下,Ad.CMV. LacZ组合和非转基因的MICA mRNA水平一直基本无变化,提示一般的腺病毒感染不会启动MICA基因的转录,而Ad.CMV.HIF-la△ODD组的MICA mRNA水平在转染后的48h较前两组有明显的升高,并在96h达到对照组的三倍。Ad.CMV.HIF-1a组的MICA mRNA水平在转染后的72h较对照组有明显升高,大约是对照组的两倍,但一直明显低于Ad.CMV.HIF-1a△ODD组。提示常氧状态下,HIF-la的表达可以上调MICA基因的转录水平。3.在缺氧再给氧的0h时,缺氧组的HK-2细胞中HIF-1a mRNA的转录水平相比正常条件下培养的对照组上调明显,并在4h时持续升高,在在8h开始下降,16h后即恢复至正常培养条件下的对照组水平。而在HIF-1a siRNA处理组中,0-16h内HIF-1a的mRNA表达水平和对照组一直没有明显的变化和差异,说明对HIF-1a转录水平的沉默抑制效果明显；并且阴性对照siRNA处理组中的HIF-1a mRNA的变化情况同缺氧组基本一致,说明转染siRNA本身不能抑制HIF-1a mRNA的转录上调。免疫荧光的结果也显示,在缺氧再给氧的0h时,在缺氧组和阴性siRNA处理组中检测到明显的HIF-1a蛋白表达,而HIF-1a siRNA处理组和正常培养条件下的对照组中则几乎检测不到HIF-1a蛋白的表达。4.在缺氧再给氧的0h时,缺氧组的HK-2细胞中MICA mRNA的转录水平相比正常条件下培养的对照组上调明显,并在4h时持续升高,在8h开始下降,16h后即恢复至正常培养条件下的对照组水平,该表达变化趋势和HIF-1a基因基本一致。而在HIF-1a siRNA处理组中,0-16h内MICA的mRNA表达水平和正常条件下培养的对照组一直没有明显的变化和差异,说明缺氧再给氧过程中对HIF-1a基因的抑制明显导致了MICA转录水平的下调；另一方面,因为阴性对照siRNA处理组中的MICA mRNA的变化情况同缺氧组基本一致,说明转染siRNA本身不能影响MICA mRNA的转录上调。结论HIF-la对人肾小管上皮细胞缺氧再给氧过程中MICA表达有重要调控作用。