严重烧伤后,包括粘膜机械屏障、固有菌群微生态屏障和免疫屏障在内的肠道三大屏障功能均有不同程度的下降,尤其是大面积严重的烧伤病人往往会更加明显和突出。另外,来源于创面的细菌也会产生大量细菌内毒素入血,这些均因素可以导致或者增加细菌内毒素(LPS)进入血液循环,爆发内毒素血症(intestinal endotoxemia,ITEM),导致全身炎症反应综合征(system inflammation response syndrome)、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome),甚至死亡。但是目前尚无有效的拮抗内毒素的药物应用于临床。抗生素的应用虽然能够有效控制细菌感染,但是却可能因抗生素对细菌菌体的破坏作用反而促进了内毒素的释放,增加了内毒素血症的危险;器官支持、重症监护技术和透析治疗,以及抗炎性细胞因子单克隆抗体或炎性细胞因子受体拮抗剂等技术和新药的使用也没有明显降低内毒素血症患者的病死率。有文献表明应用健康志愿者的多克隆免疫血浆可以显著降低内毒素血症患者的死亡率,但是其来源受到极大的限制而无法大规模应用于临床治疗。不过,多克隆抗体还是被人们寄予了很大的期望,因为内毒素是个结构复杂的大分子物质,有着众多可能完全不同的表位,而单克隆抗体却因为太高的专一性,限制了其识别其他的表位,从而降低了其使用的临床效果,多克隆抗体却由于可以识别更多的不同表位,覆盖了更多的潜在结合点,更有利于发挥抗体的结合拮抗功能,提高临床治疗效果。卵黄抗体是来源于免疫鸡蛋的一种免疫球蛋白,以产量高、制备工艺相对简单、成本较低以及良好的稳定性和特异性等优点逐步被人们所重视,国内外众多的研究也证明该免疫球蛋白对相应的抗原有较强的结合拮抗作用,因此IgY技术的研究和开发也获得了重要的进展。目前,IgY技术已经在免疫学检测、预防和治疗细菌、真菌及病毒感染、肿瘤抑制等方面发挥着日益重要的作用。更重要的是IgY是来源于禽类的多克隆抗体,由于种系差异,研究发现IgY可以识别更多哺乳动物不能识别的表位,从而增强了其发挥中和拮抗效应的功能。我们前期的研究结果已经显示出抗内毒素IgY良好的拮抗内毒素功能。当给与严重烧伤后肠源性内毒素损伤小鼠口服抗内毒素卵黄抗体治疗后,小鼠循环血中TNF-a、IL-6及IL-1β水平较未接受抗内毒素卵黄抗体治疗组显著显著下降,小鼠死亡率也显著降低;另有文献报道,当腹腔注射大肠杆菌后小鼠,小鼠体重下降,外周血中WBC和PLT数均有不同程度的下降,七天死亡率可达100%。当给予特异性IgY腹腔注射保护后,小鼠的上述各项指标较快恢复到正常水平,七天死亡率显著下降,且治疗效果呈现出特异性IgY的剂量依赖性。聂荣庆等报道特异性IgY可显著提高中性粒细胞吞噬灭活金黄色葡萄球菌的吞噬率和吞噬指数,且同样表现出IgY的剂量依赖性。国外也有众多文献报道特异性IgY可以显著改善相应病原菌感染损伤程度的报道,其具体作用机制尚缺乏了解。本研究旨在获得高纯度、高效价的抗内毒素IgY并对其拮抗内毒素损害的相关机制进行探讨。本研究用纯品LPS配合使用完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂采用皮下注射和肌肉注射相结合的多点免疫法免疫产蛋罗曼鸡,分别采用改良水溶法(WD法)、硫酸钠分级沉淀法和凝胶层析法从蛋黄液中制备、提取、纯化特异性抗内毒素IgY,并对其产量、纯度、抗体效价等进行检测,结果显示通过上述方案可以获得高纯度、高效价的抗内毒素IgY;小鼠动物实验显示体外共孵育抗内毒素IgY和LPS后,腹腔注射LPS的致死效应显著降低,抗内毒素IgY可以显著提高腹腔注射LPS攻击下的小鼠生存率;体外实验显示抗内毒素IgY可以显著提高PMA诱导的THP-1细胞吞噬荧光微球的能力,而未免疫IgY却不能。体内研究也发现当连续七天腹腔注射给予抗内毒素IgY后,小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能显著增强,其吞噬荧光微球的吞噬率和吞噬指数显著提高,与未免疫IgY组和PBS组相比差异显著。另外,抗内毒素IgY可以在体外显著抑制PMA诱导的THP-1细胞分泌TNF-a的能力,还可以显著抑制LPS攻击THP-1细胞产生TNF-a的能力且当LPS攻击一小时后再使用抗内毒素IgY同样可以显著抑制上述细胞TNF-a的分泌。但流式细胞术检测显示抗内毒素IgY并不能显著降低PMA诱导的THP-1细胞表面CD14的表达,而TLR4的表达所受到的影响也很小;体外细胞实验还证实当抗内毒素IgY与FITC-LPS共孵育后,FITC-LPS与PMA诱导的THP-1细胞结合率显著下降,说明抗内毒素IgY可以显著抑制LPS与靶细胞的结合。这可能也是抗内毒素IgY抑制PMA诱导THP-1细胞分泌TNF-a能力的原因之一。根据本研究的实验结果结合以前研究结果,我们可以看出抗内毒素IgY有较好的拮抗LPS损伤作用,其机制可能是1,抗内毒素IgY可以增强巨噬细胞等机体吞噬细胞的吞噬功能,增强机体清除致病因子的能力;2,抗内毒素IgY可以通过某种路径,在不能影响CD14或TLR4表达的情况下显著抑制内毒素攻击下巨噬细胞分泌TNF-a等炎症介质的能力,减轻炎症反应程度;3,抗内毒素IgY可以识别、结合细菌内毒素,并有效抑制内毒素与巨噬细胞等靶细胞的结合,阻断后续损害效应的发生。