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目的动脉粥样硬化是一个由血脂异常、细胞炎症、细胞增殖、高血压、氧化应激、胰岛素抵抗等联合导致的多因子疾病,既往研究认为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)磷酸化在调节糖脂代谢方面作用显著,能够间接影响动脉粥样硬化。然而其对动脉粥样硬化的直接作用尚不明确。本研究旨在通过观察PPARγ磷酸化在Raw264.7巨噬细胞泡沫细胞形成和炎症反应中的作用,探讨其参与调节动脉粥样硬化发生发展机制。方法本研究使用氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导Raw264.7巨噬细胞构建泡沫细胞模型,以Roscovitine(PPARγ磷酸化间接抑制剂)进行干预,实验设置为3组,即对照组、ox-LDL组、抑制剂组。利用Western blot检测各组pPPARγ、PPARγ、细胞周期素依赖蛋白激酶5(Cyclindependent kinase 5,CDK5)和其激活因子p35的蛋白表达变化;油红O染色和异丙醇萃取实验分析各组细胞内脂质聚积情况;酶法测定细胞内胆固醇含量;Western blot和PCR法分别检测ox-LDL摄取相关蛋白CD36、A1类清道夫受体(Class A1 scavenger receptor,SR-A1)和胆固醇外流相关蛋白ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、ATP结合盒转运体G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)的蛋白表达和mRNA水平;ELISA和PCR法分别检测促炎因子肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)的分泌和表达,初步观察PPARγSer273磷酸化与泡沫细胞形成和炎症的关系。为验证上述变化,我们将PPARγ273位点进行突变,构建并筛选出稳定表达PPARγ野生型(Wild type,WT)和Ser273位点突变型Raw264.7巨噬细胞,并分别加入ox-LDL刺激,实验设置为4组,即WT组、WT+ox-LDL组、S273A组、S273A+ox-LDL组。Western blot分别检测各组巨噬细胞中pPPARγ和PPARγ的表达水平,Western blot和PCR法检测巨噬细胞中CD36、SR-A1、ABCA1和ABCG1的蛋白和mRNA表达水平;ELISA和PCR法检测各组巨噬细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β的分泌和mRNA表达水平。结果1.Raw264.7巨噬细胞经不同浓度ox-LDL或Roscovitine处理的MTT结果显示,大于50 mg/L的ox-LDL和大于15μmol/L的Roscovitine对细胞有明显的抑制作用,因此选择50 mg/L ox-LDL和15μmol/L Roscovitine进行后续实验。2.对不同组别泡沫细胞形成情况进行观察,结果表明,细胞经ox-LDL处理后细胞内脂质聚积、总胆固醇含量、游离胆固醇含量、胆固醇酯/总胆固醇比值均升高,加入抑制剂后,上述指标均降低,说明抑制剂成功干预泡沫细胞形成。3.ox-LDL诱导pPPARγ/PPARγ和p35/CDK5比值增加,加入Roscovitine可拮抗上述变化,说明PPARγSer273磷酸化与CDK5活性有关。结合泡沫细胞形成结果,可以看出,CDK5介导的PPARγSer273磷酸化可能参与泡沫细胞形成。4.蛋白和mRNA结果显示,ox-LDL组摄取相关蛋白CD36和SR-A1蛋白和mRNA表达水平与PPARγSer273磷酸化一致,而胆固醇外流相关蛋白ABCA1和ABCG1蛋白和mRNA表达水平与PPARγSer273磷酸化变化相反,说明PPARγSer273磷酸化参与了泡沫细胞形成机制。5.ELISA和mRNA结果显示,促炎因子TNF-α和IL-1β分泌和mRNA表达水平与PPARγSer273磷酸化一致,说明PPARγSer273磷酸化参与炎症反应。6.成功构建稳定表达PPARγWT和Ser273位点突变型Raw264.7巨噬细胞,首先将PPARγ沉默,使用Western blot检测其沉默效率,可见,与未处理组和无关对照组相比,实验组未检出PPARγ,表明PPARγ沉默成功;向沉默成功的细胞中转入WT型和Ser273位点突变型质粒,Western blot结果显示,与WT组相比,S273A组不再检测出PPARγ磷酸化水平,提示细胞系构建成功。7.通过ox-LDL诱导稳定表达PPARγWT和Ser273位点突变型细胞,观察CD36和SR-A1,ABCA1和ABCG1以及炎症因子TNF-α和IL-1β的变化与PPARγSer273磷酸化的关系,可见,无论是否接受ox-LDL刺激,突变后均表现为CD36和SR-A1表达降低,ABCA1和ABCG1表达升高,TNF-α和IL-1β水平也降低。进一步验证了PPARγSer273磷酸化在泡沫细胞形成和炎症反应中的作用。结论1.PPARγSer273磷酸化促进泡沫细胞形成。2.PPARγSer273磷酸化可以调节Raw264.7巨噬细胞中ox-LDL摄取相关蛋白CD36、SR-A1和胆固醇外流相关蛋白ABCA1、ABCG1的表达,诱导巨噬细胞胆固醇聚积,促进泡沫细胞形成,进而加速动脉粥样硬化的发生。3.PPARγSer273磷酸化通过促进炎症因子TNF-α、IL-1β的分泌和表达诱导Raw264.7巨噬细胞炎症反应,进一步加速泡沫细胞形成,促进动脉粥样硬化进程。4.通过探讨PPARγSer273磷酸化在动脉粥样硬化泡沫细胞形成中的作用,为基于此机制的抗动脉粥样硬化药物的应用和研发提供有力依据。