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目的乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤,在欧洲及北美等发达地区,乳腺癌的发病率长期位列女性恶性肿瘤的第一位。随着经济的发展,我国大城市和沿海发达地区的发病率也开始呈现迅速上升的趋势,其发病率也已成为女性所有恶性肿瘤中的第一或第二位,严重威胁女性健康。目前在临床上治疗乳腺癌的手段主要有手术治疗、化疗和内分泌治疗,分子靶向治疗刚刚崭露头角,但是相较于传统的治疗手段,它已经显示出巨大的潜在价值。所以,寻找能够对乳腺癌进行早期诊断,或能准确判断其预后,以及能为分子治疗提供新靶点的基因,对于乳腺癌基因治疗的发展和推广就显得尤为重要。目前在分子肿瘤学领域的热点之一就是对肿瘤细胞周期的研究,细胞周期蛋白家族(Cyclins)自然而然就进入了广大研究者的视野,而其中的细胞周期蛋白E(Cyclin E)作为一个已经确定的癌基因,作为细胞周期中G1/S期的关键调节蛋白,其研究价值正日渐浮出水面。近年来,很多国内外乳腺癌疾病的研究者都注意到了Cyclin E,尤其是低分子量剪切型Cyclin E(LMW Cyclin E)同乳腺癌预后之间的密切关系。本课题正是从Cyclin E在乳腺癌组织中的表达水平入手,总结Cyclin E的表达同乳腺癌患者预后之间的关系。接着以RNAi为干预手段,设计可以抑制Cyclin E表达水平的实验工具,在体内及体外水平分别抑制乳腺癌中Cyclin E的表达,进而分析Cyclin E对肿瘤生物学行为的影响并试图挖掘Cyclin E作为一个乳腺癌基因治疗新靶点的潜在价值。方法收集华中科技大学同济医学院附属协和医院病理科2000-2003年部分乳腺病检蜡块,结合其相应的临床资料,按国际抗癌学会(UICC)及美国癌症联合会(AJCC)建议的TNM分期法(第六版)对其进行临床分期。其中乳腺良性肿瘤18例,恶性肿瘤(乳腺癌)80例,平均年龄50岁,所有患者于手术前未接受任何抗癌治疗。用免疫组织化学法检测上述研究对象中Cyclin E蛋白的表达,以及C-erbB-2(HER-2/neu)、nm23-H1、actin(肌动蛋白)的表达。根据Cyclin E cDNA序列设计引物。再依照载体法合成siRNA的原则选择2段靶序列,设计并合成Cyclin E基因的siRNA片段,退火后于pGENSIL-1载体连接,构建Cyclin E基因的siRNA真核表达载体。再用该载体瞬时转染人乳腺癌细胞株MCF-7,检测转染前后对照组及转染组中Cyclin E mRNA的表达与蛋白水平的表达,CCK-8法检测siRNA对细胞的抑制效应,流式细胞术检测细胞周期。分别用对照组及转染组MCF-7细胞建立裸鼠移植瘤模型,绘制肿瘤生长曲线。取一部分荷瘤裸鼠模型以siRNA进行肿瘤局部注射,模拟基因治疗,并绘制肿瘤生长曲线。结果Cyclin E在良、恶性肿瘤组织中过表达的差异性有极显著的统计学意义(χ2=13.29,P<0.01),即在良性乳腺肿瘤中Cyclin E的过表达率很低,而在乳腺癌组织中Cyclin E的过表达率较高;而在乳腺癌的不同组织类型中Cyclin E过表达的差异性没有统计学意义(χ2=0.1099,P>0.05)。在临床分期较早的乳腺癌组织中Cyclin E的过表达率较低,而在临床分期较晚的乳腺癌组织中Cyclin E的过表达率较高,且随着临床分期的进展,Cyclin E的过表达率也相应地升高。ER阳性的乳腺癌组织中Cyclin E的过表达率较ER阴性者为低,其Cyclin E过表达率的差异具有显著的统计学意义(χ2=4.1112,P<0.05)。在PR阳性或阴性的乳腺癌组织中,Cyclin E阳性表达率的差异性没有显著的统计学意义(χ2=1.3267,P>0.05)。在C-erbB-2(HER-2/neu)呈阳性表达乳腺癌组织中,Cyclin E的阳性表达率较高;而在C-erbB-2(HER-2/neu)呈阴性表达的乳腺癌组织中,Cyclin E的阳性表达率较低,这一阳性表达率的差异性有着显著的统计学意义(χ2=4.0635,P<0.05)。在nm23-H1表达呈阳性和阴性的乳腺癌组织中,Cyclin E的阳性表达率的差异性没有显著的统计学意义(χ2=1.6737,P>0.05)。actin呈阴性表达或是呈不连续分布即恶性度高的乳腺癌组织同actin呈阳性表达且分布连续的恶性度低的乳腺癌组织相比,其Cyclin E的阳性表达率的差异有着显著的统计学意义(χ2=4.2092,P<0.05)。成功地设计并合成了序列ctrl,CCNE-1和CCNE-2,其测序结果与我们设计合成的靶向Cyclin E的反义链完全一致,并将上述目的基因正确地插入pGENESIL-1载体,成功构建重组质粒。转染24 h后的转染效率约50%。转染48h后实验组细胞内Cyclin E的mRNA RT-PCR产量明显低于空白对照及阴性对照组。siRNA作用于细胞后,Western Blot检测显示Cyclin E蛋白水平的表达有显著降低。经化疗药物处理后,转染后细胞的抑制率较未转染细胞有明显上升,且这一差异有统计学意义。转染siRNA后,乳腺癌细胞被大量阻滞于G1期。动物实验方面,对照组裸鼠移植瘤生长速度较转染组快,瘤体体积也较大。空白对照组和生理盐水对照组中裸鼠移植瘤的生长较siRNA局部注射治疗组迅速,肿瘤体积也较大。结论在一定程度上,Cyclin E的过表达可以反映乳腺的良、恶性病变的差异,Cyclin E的表达与乳腺癌临床分期密切相关,即由Ⅰ期至Ⅳ期阳性表达率逐渐升高,或可将其作为一个判断乳腺肿瘤预后的分期性指标。抑制乳腺癌细胞中Cyclin E的表达可以显著抑制肿瘤细胞的生长,提高肿瘤对化疗的敏感性,抑制肿瘤细胞的成瘤能力,Cyclin E siRNA对肿瘤生长亦具有抑制作用。Cyclin E具有成为乳腺癌基因治疗新靶点的潜在价值。