黄瓜(Cucumis sativus L.)是市场需求量较大的蔬菜作物之一,然而在设施栽培中特别是反季节栽培中,由于湿度大、温度低、雄花少、病害严重等不利因素严重影响了黄瓜的生长及产量,造成经济损失。因此,研究黄瓜果实发育机理、多方面增强黄瓜生长势、增加座果率有利于切实解决生产中所存在的问题。植物生长发育是受多类基因调控的复杂过程,其中有一类扩张蛋白基因(expansin)作用于植物细胞壁,通过引起细胞壁松弛促进细胞伸展与分裂。多年来,关于扩张蛋白影响植物生长发育的报道越来越多。本研究在对黄瓜果实转录组学研究的基础上发现了在果实发育过程中差异表达的Csa5M561760.1基因,且属于β-expansin基因家族。GeneBank登录号为 XP011655449,本研究克隆了此基因,将之命名为CsEXPb1,并开展了此基因相关的功能研究,主要研究内容及结果如下:1.黄瓜扩张素蛋白基因CsEXPb1的克隆及表达分析本研究以黄瓜品种’EC1’雌花cDNA、雄花cDNA以及叶片总DNA为模板,克隆得到目的基因,全长942 bp,其中开放阅读框(ORF)长度为549 bp,共编码182个氨基酸。序列分析及同源比对结果显示该基因序列与豆科、茄科、禾本科等多种作物的钙调素类似蛋白CML同源性较高,同时目的蛋白含有2个EF手形(EF-hand)结构的保守域,与钙离子结合形成Ca2+·CaM复合物,通过与靶酶作用调控生理代谢过程。ExPasy分析发现CsEXPb1为亲水性蛋白,亚细胞定位分析也证明该蛋白广泛存在于细胞膜、细胞质以及细胞核结构中。组织表达分析显示该基因在根、茎、成熟叶片及雄花中表达量很少,但在幼叶和雌花这些细胞增殖速度较快的组织器官中表达量较高。该基因在果实发育中的表达分析结果显示CsEXPb1在开花后0～6d,’EC1’子房和’8419’授粉子房中表达量持续升高,但在’8419’未授粉子房中CsEXPb1在4d时开始下调表达,且远远低于同期的’EC1’和’8419’授粉子房。CsEXPb1对外源激素的应答显示该基因的表达受外源激素GA、6-BA及NAA的诱导。2.CsEXPb 基因正反义植物表达载体的构建利用PstⅠ和XbaⅠ双酶切含目的基因片段的克隆载体PMD19-T和空植物表达载体PLP35S-100,将CsEXPb1基因正反向插入到植物表达载体PLP35S-100上,并通过冻融法把重组质粒导入到农杆菌菌株C58中。成功构建了以CaMV35S为启动子,CaMV35S和NOS为终止子,GUS基因为报告基因,NPT Ⅱ基因为选择标记基因的CsEXPb1正反义植物表达载体PLP100-CsEXPb1。3.CsEXPb1基因在黄瓜上的遗传转化及功能研究将CsEXPb1基因正反义表达载体分别在非单性结实品种’8419’和单性结实品种’EC1’中瞬时表达,结果显示,超表达该基因能促进子房发育,抑制该基因表达则减慢发育速度,因此推测其影响黄瓜果实发育。以黄瓜品种’长春密刺’为转基因材料,利用农杆菌介导的子叶节法进行黄瓜的遗传转化。最高分化率达96.2%,对抗性芽进行表型观察及分子鉴定得到1株转基因To代植株,编号To-M-1。用To-M-1雄花的花粉给普通长春密刺授粉得到500粒T1代种子。将一部分T1代种子进行Kan筛选后种植共计242株。对这242株T1代进行NPT Ⅱ鉴定、斑点杂交和表达分析后,鉴定得到3株T1代转基因植株,编号T1-79、T1-173及T1-177。通过对To-M-1和T2代表型观察后发现转基因植株幼嫩期长势快于普通’长春密刺’,花芽分化早且部分单株后期出现“花打顶”现象,因此我们推测CsEXPb1基因能促进幼嫩组织的发育与花芽分化,且影响顶端组织发育。