背景非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指一种肝组织学改变与酒精性肝病相似,但无过量饮酒史的临床病理综合征,其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)和肝硬化。NASH的组织病理学特征主要为肝细胞的损伤和脂肪变、肝脏的炎症改变和轻重程度不一的肝纤维化,是由单纯性脂肪肝发展至肝纤维化及肝硬化的重要转折点。近年来随着我国经济的发展、生活方式和饮食结构的改变,NASH发病率呈明显上升趋势,但是NASH的发病机制至今尚未完全阐明。目前比较成熟的“二次打击”学说认为氧化应激损伤是肝脏发生脂肪变以及进一步发展为NASH的重要因素。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化和增殖被认为是肝纤维化发生发展的核心环节。生理状态下HSC的主要功能是储存脂肪和维生素A。在各种因素刺激下,HSC被激活,转化为肌成纤维细胞,具有增殖、分泌细胞因子、分泌大量细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的特性。由于活化的HSC是肝脏ECM分泌的主要来源,因此HSC被认为是预防和治疗慢性肝病的重要靶细胞。转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是细胞防御氧化应激反应的重要转录因子,它可以与抗氧化反应元件(antioxidant-response element, ARE)结合,上调抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达,增强细胞的抗氧化能力。最近研究认为Nrf2是细胞抗氧化反应的中枢调节者,Nrf2能够维持细胞内的氧化平衡,降低细胞对死亡信号的敏感性,在细胞抵御外源性或内源性氧化应激的机制中发挥重要作用。但目前关于Nrf2的研究多集中在神经系统、呼吸系统等领域,Nrf2在HSC氧化应激损伤中的作用及机制尚未见报道。本实验以大鼠HSC-T6为研究对象,制备氧化应激的细胞模型,研究HSC内Nrf2表达以及观察氧化应激对其表达的影响,并上调HSC内Nrf2核转位水平,观察Nrf2对HSC氧化应激损伤的保护作用。目的本实验采用葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GO)制备大鼠HSC-T6的氧化应激模型,观察氧化应激对HSC中Nrf2核转位的影响,研究能否通过姜黄素促进Nrf2核转位而改善HSC的氧化应激损伤及纤维化状态,为以Nrf2为靶点进行NASH的防治提供新的实验基础和理论依据。方法1.将HSC-T6分成阴性对照组和氧化应激组。阴性对照组:正常培养未给予任何干预;氧化应激组:仅加入100 U/L GO干预2 h,制备氧化应激细胞模型。Western blot法和细胞免疫化学法观察Nrf2表达的变化,流式细胞术检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)水平的变化,分光光度法检测丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)水平。2.将大鼠HSC-T6分成阴性对照组、氧化应激组和姜黄素干预组三组。阴性对照组、氧化应激组按照方法1造模,姜黄素干预组先加入30μmol/L姜黄素干预3 h,再给予100 U/L GO干预2 h。用细胞免疫化学法和Western blot法观察Nrf2的表达,间接免疫荧光法观察HSC的活化水平,流式细胞术检测细胞内ROS水平,分光光度法检测MDA、GSH水平,放射免疫法检测ECM的分泌水平。结果1.本实验用GO法成功建立大鼠HSC-T6的氧化应激模型,氧化应激组ROS及MDA水平较阴性对照组显著升高(P<0.01)。2. Western blot的结果显示氧化应激组与阴性对照组Nrf2总蛋白表达未见明显差异,而阴性对照组Nrf2核蛋白未见明显表达,氧化应激组Nrf2核蛋白表达明显增加;细胞免疫化学染色结果显示,阴性对照组Nrf2蛋白的阳性表达仅见于胞浆,胞核内未见Nrf2蛋白明显表达,而氧化应激组Nrf2蛋白在胞浆和胞核中均可见阳性表达;分光光度法结果显示氧化应激组GSH水平较阴性对照组明显增加(P<0.01)。3.姜黄素干预组与氧化应激组、阴性对照组相比较,Western Blot结果显示各组中Nrf2总蛋白的表达未见明显变化,氧化应激组中Nrf2胞浆蛋白的表达较阴性对照组有所下降,姜黄素干预组中Nrf2胞浆蛋白的表达较氧化应激组下降明显。细胞免疫化学染色的结果同样显示各组中Nrf2的总体表达未见明显差异,阴性对照组中棕色颗粒均集中在胞浆中,胞核内未见阳性表达;氧化应激组中棕色颗粒的表达大多在胞浆中,胞核内也有少量表达;姜黄素干预组中棕色颗粒的表达大多集中在胞核内,胞浆中的表达明显下降。4.间接免疫荧光法结果显示,Desmin在各组细胞中均呈阳性表达,但是在阴性对照组中α-SMA未见阳性表达,氧化应激组中α-SMA的阳性表达明显增加,姜黄素干预组中α-SMA可见少量表达。5.流式细胞术结果显示,氧化应激组的DHE荧光强度最强,阴性对照组的DHE荧光强度最弱,姜黄素干预组的DHE荧光强度居中(P<0.01)。分光光度法结果显示,氧化应激组中MDA水平较阴性对照组明显增高(P<0.01),姜黄素干预组中MDA水平较氧化应激组显著降低(P<0.01)但仍高于阴性对照组;与阴性对照组相比,氧化应激组中GSH水平有所提高(P<0.01),而姜黄素干预组中GSH水平升高明显(P<0.01)。6.放射免疫法结果显示,氧化应激后培养基中Ⅲ型前胶原蛋白(type-Ⅲprocollagen, PCⅢ)、Ⅳ型胶原蛋白(type-Ⅳcollagen collagen, CⅣ)、层粘连蛋白(laminin, LN)和透明质酸(hyaluronic acid, HA)的分泌明显增加(P<0.01),姜黄素干预组中PCⅢ、CⅣ、LN和HA的表达较氧化应激组有所下降(P<0.01),但仍高于阴性对照组。结论本实验成功制备了大鼠HSC的氧化应激细胞模型,发现氧化应激条件下HSC内Nrf2发生核转位并发挥其抗氧化作用。同时也表明,通过姜黄素干预能够上调Nrf2的核转位水平,减轻细胞氧化应激损伤,进而抑制HSC活化,减少ECM分泌,为以Nrf2为靶点治疗和预防NASH提供了新的理论基础和实验依据。