血红素(Heme)是含有铁离子的卟啉化合物,作为过氧化物酶等多种酶的辅因子,具有多种重要的生物学功能。本论文旨在探究大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)血红素前体转运蛋白的表达对于血红素合成代谢的影响。通过构建前体转运蛋白基因rhtA与tolC缺失菌株,分析血红素及其前体含量的变化;基于转录组以及qRT-PCR实验结果,阐述缺失菌株中血红素合成的调控机制。主要研究结果如下:(1)血红素前体转运蛋白的表达调控。通过Red同源重组的方式,构建大肠杆菌rhtA缺失、tolC缺失和tolC、rhtA双缺失菌株WT-R、WT-T与WT-RT。通过一步克隆方式构建rhtA、tolC与双缺失基因的回补菌株pET-R、pET-T与pRT-TR。将过表达hemA基因的质粒pEA分别转入WT、WT-R、WT-T与WT-RT中,得到菌株pEA、pEA-R、pEA-T与pEA-RT。生长曲线测定结果表明tolC、rhtA缺失对于E.coli生长没有显著影响。(2)血红素前体转运蛋白表达对于血红素合成的影响。与原菌株WT相比,WT-R胞外5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)减少23%、胆色素原(Porphobilinogen,PBG)提高15%,胞内尿卟啉III(Uroporphyrin III,UIII)、粪卟啉III(Coproporphyrin III,CIII)和原卟啉IX(Protoporphyrin IX,PPIX)分别提高25%、15%和18%,Heme增加12%;WT-T ALA减少30%、PBG减少39%,UIII、CIII和PPIX分别提高4、14和6倍,Heme减少26%;WT-RT ALA减少30%、PBG减少12%,UIII外、CIII和PPIX分别提高19%、3倍和15倍,Heme增加4%。在过表达Heme合成途径中的关键酶基因hemA后,pEA-R与pEA相比,ALA减少16%,PBG减少14%,UIII、CIII与PPIX分别提高55%、64%和470%,Heme提高24%;pEA-T ALA减少16%,PBG增加5%,除UIII外,CIII和PPIX分别提高17和1.8倍,Heme减少24%;pEA-RT ALA减少24%,PBG减少15%,UIII减少40%,CIII和PPIX分别提高33和19倍,Heme增加5%。(3)基因缺失菌株血红素合成机理分析。tolC与rhtA缺失导致编码铁螯合酶的基因hemH转录上调或变化不大,而tolC缺失导致编码谷氨酰-tRNA合成酶(GlutamyltRNA synthetase)基因gltX与hemA下调,对于血红素与ALA合成均有一定抑制,造成ALA与血红素积累减少,胞外PBG减少,促使代谢物进一步流向血红素合成。与rhtA不同,tolC缺失引起胞外ALA减少可能是由于tolC缺失造成总ALA减少。在tolC缺失菌株WT-T以及tolC缺失同时过表达hemA菌株pEA-T中胞内卟啉积累,但与对照菌株相比血红素产量反而减少,可能与tolC缺失导致铁离子匮乏有关。转录组分析结果显示转录调控因子arcA、亚铁转运蛋白feoB下调,全局转录调控因子fur上调,造成血红素产量的差异。