论文部分内容阅读
雄全异株是被子植物中最为稀有的一类繁育系统。最近,人工授粉实验及父本分析结果均证明瘿椒树Tapiscia sinensis(瘿椒树科)为功能性的雄全异株。其种群中既存在雄性个体又存在两性个体,并且两性个体自交可育,但是两性花粉活力远远低于雄性。组织化学染色及糖代谢相关基因表达分析结果表明,和雄花相比,两性花糖类物质转运和代谢异常。花药发育的液泡化小孢子(VM)阶段,两性花药中的多糖类物质大量积累在药隔组织中,不能正常转运进花药室供花粉发育使用。绒毡层作为花粉发育所需营养物质转运及合成的关键部位,和雄性相比,其在两性花中的发育过程是否正常?此外,两性绒毡层发育核心基因的表达是否正常?这些基因之间的互作,调控关系是怎么样的?与模式植物拟南芥有哪些异同?为了探明这些问题,我们对瘿椒树雄性及两性花药绒毡层及小孢子的发育过程进行了对比观察,分析了绒毡层发育核心基因的表达情况,此外,对这些基因的互作及调控关系进行了初步的探究。本论文的主要研究结果如下:(1)利用半薄切片对雄性及两性花药发育过程对比,结果表明,当早期小孢子从胼胝质壁游离出来之后,两性花绒毡层细胞质逐渐变得浓密,小孢子细胞质逐渐收缩,花粉壁出现缺陷。(2)超微结构观察发现,与雄花相比,两性花绒毡层细胞物质合成和分泌功能受到阻滞,PCD过程出现延迟,同时,花粉外壁外层的顶盖结构粘连在一起,花粉外壁内层出现缺陷,而花粉内壁自始至终都没有形成。(3)qRT-PCR结果表明,TsDYT1不在营养器官及果实中表达,只在花中表达,并且,在四分体(Tds)和早期小孢子(YM)阶段,其在两性花中的表达量显著低于雄花;原位杂交结果表明,TsDYT1在绒毡层和小孢子中强烈表达;亚细胞定位分析结果表明TsDYT1蛋白主要在细胞核中表达。(4)与雄花相比,绒毡层发育核心转录因子TsTDF1,TsAMS和TsMS1在两性花中也异常表达。(5)成功克隆到TsDYT1,TsTDF1,TsAMS和TsMS1的基因及启动子序列。基因结构分析结果表明,TsDYT1,TsTDF1,TsAMS和TsMS1分别包含的外显子个数为4,3,8,3,并且启动子区域均包含的E-box顺式作用元件;瘿椒树,拟南芥,水稻这三个物种中的序列比较结果表明,这四个基因的氨基酸序列均与他们在拟南芥中对应的直系同源基因有着最高的相似性;系统进化树分析结果表明,这四个基因均与拟南芥中的亲缘关系相对较远,与水稻最远。(6)酵母双杂交(Y2H)结果表明,TsDYT1不能与TsTDF1互作,但是可以与TsAMS互作;酵母单杂交分析结果表明,TsDYT1可以结合TsTDF1的启动子序列,并且结合位点位于其起始密码子ATG上游的616至720 bp 区域;但是,TsDYT1与TsAMS的启动子(起始密码子上游787 bp)及TsMS1的启动子(起始密码子上游1176 bp区域)不存在互作。综合上述研究结果,我们认为瘿椒树两性花药绒毡层的异常发育,引起了其花粉壁的缺陷,导致了两性较低的花粉活力,最终促进了瘿椒树雄全异株种群的维持。而两性绒毡层异常发育与绒毡层发育核心基因TsDYT1,TsTDF1,TsAMS和TsMS1的异常表达有关。此外,瘿椒树绒毡层发育调控通路与模式植物拟南芥即存在保守性,也存在着一些差异。