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目的体外观察Bufalin和Sorafenib联合应用对人肝癌细胞株的增殖抑制作用,确定二者联合作用的关系并探索二者联合作用的机制。材料与方法1.采用CCK-8法测定Bufalin、Sorafenib单用及合用对人肝癌细胞株PLC/PRF/5和HepG-2的增殖抑制作用,应用Chou-Talalay联合指数法(即中效原理)判定两药合用相互作用关系。2.采用Western Blot技术,检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5和HepG-2中pERK、ERK、pAKT、AKT、FoxO3a蛋白表达差异结果1. Bufalin、Sorafenib单用及合用作用于人肝癌细胞株PLC/PRF/5和HepG-248小时后,Bufalin的IC50分别为157.87nM、33.65nM; Sorafenib的IC50分别为3565.7nM、5719.21nM; Bufalin联合Sorafenib的IC50分别为105.83 nM (Bufalin 53.02nM+Sorafenib 1325.41nM)、27nM (Bufalin 13.52nM+Sorafenib 338.03nM)。在HepG-2细胞联合用药组产生<40%抑瘤率时表现为协同,而在PLC/PRF/5细胞联合用药组产生<80%抑瘤率时表现为协同。2.应用Western Blot检测药物作用8小时后,HepG-2 (p53+)和PLC/PRF/5(p53-)中AKT、pAKT、ERK、pERK、FOXO3a表达的结果显示Bufalin 50nM、500 nM可轻度上调pAKT的表达,对pERK蛋白表达无明显的促进或抑制作用。Sorafenib 1.25μM、12.5μM均抑制pERK蛋白的表达,对pAKT蛋白表达没有影响。低剂量的Bufalin与Sorafenib联合应用后可以明显的上调pAKT,抑制pERK,并下调F0X03a。应用PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002后,给予LY294002处理的联合用药与未给予LY294002处理的联合用药组相比,pAKT上调不明显,pERK表达升高。结论1. Bufalin联合Sorafenib能协同抑制人肝癌细胞株的生长,且PLC/PRF/5对Bufalin与Sorafenib联合使用的敏感性较HepG-2高。2. Bufalin联合Sorafenib协同抑制人肝癌细胞株的可能机制是：a)Bufalin联合Sorafenib可以抑制pERK的表达,从而抑制肝癌细胞的生长；b)且Bufalin联合Sorafenib可以上调pAKT的表达,激活ROS(活性氧)通路,下调FoxO3a,诱导细胞衰老(HepG-2p53+)或死亡(PLC/PRF/5 p53-); c)同时MAPK信号通路与PI3K/Akt信号通路之间存在交叉对话(Crosstalk),上调的pAKT可以抑制pERK的表达,促进细胞死亡。