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嗜热真菌是一类适于在极端高温条件生存的真核生物,对其生长和发育研究不仅有助于解析真核生物的起源与进化,更有利于揭示真核生物对逆境的适应和抗性分子机制;同时也为嗜热微生物资源的发掘、遗传改良和高效利用提供理论证据。疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）和嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）是两种常见的嗜热真菌,普遍高频率同时出现于堆积的秸秆、粪便或其它有机废弃物中。本实验室前期研究发现,这两种嗜热菌虽然在培养形状和生物化学属性方面高度一致,但生殖方式和寿命等方面却相差极大。基于两种嗜热真菌的基因组和转录组生物信息,本研究以从东北寒区分离的T.lanuginosus和C.thermophilum为材料,针对在真菌发育相关的两类膜蛋白,即膜联蛋白基因ANXC7（Annexin C7）和性别分化过程蛋白基因SDP（Sexual differentiation process protein）进行功能解析。通过基因敲除和功能基因互补等遗传学手段创制了系列敲除转化子和功能互补转化子,本研究从生物学、生理生化和分子生物学角度全面解析了1个ANXC7基因和4个SDP基因在嗜热真菌生长、发育和生存过程中的作用。膜联蛋白（Annexin）广泛分布于真菌、植物和动物,具有一定序列同源性和结构相似性,参与多种细胞生理和生化过程。本研究从疏棉状嗜热丝孢菌中鉴定获得了一个生长发育相关Annexin 7家族基因（Thela2p4001773）,命名为ANXC7基因。ANXC7基因全长为1404bp,包括了一个内含子和两个外显子。ANXC7基因编码由466个氨基酸组成的盘状蛋白质。ANXC7蛋白质包含四个annexin重复（Annexin repeat）和两个钙离子结合位点,定位于细胞膜和线粒体中。研究发现,ANXC7基因缺失不影响疏棉状嗜热丝孢菌的生长速率和细胞壁完整性,但一定程度改变菌株在CM液体培养基中的表型并增加生物量。膜疏水性实验表明,ANXC7基因缺失降低了疏棉状嗜热丝孢菌的膜疏水特性。虽然ANXC7基因缺失对膜完整性影响不明显,但却增加了菌体对外界过氧化氢的抗性,有趣的是,菌体内源过氧化氢的水平也较低,说明ANXC7可能负调控内源过氧化物的形成。ANXC7基因缺失突变体（ΔANXC7）分生孢子的形成、发育（成熟和脱落）提前,但分生孢子的产量并无显著变化,说明ANXC7与孢子发育过程相关。性别分化过程蛋白基因（Sexual differentiation process protein gene）简称SDP,具有寡肽转运蛋白（oligopeptide transporter）活性。其研究主要集中在酵母等低等真菌SDP蛋白对氮源的选择性利用方面。本研究全面鉴定了疏棉状嗜热丝孢菌和毛壳菌中的4个SDP基因（Thela2p4001542,Chath2p7003666,Chath2p7006558和Chath2p7016947）。同源性比较发现,4个基因编码的蛋白质属于OPT（oligopeptide transporter）转运蛋白家族。这些基因具有多个跨膜结构和OPT家族的特殊结构域SPYx EVRxx Vxxx Dxxx。酵母OPT基因最早从有性生殖细胞的分化时期分离,可能与酵母有性生殖细胞的分化有关,但其功能一直没有确认。本研究重点探讨四个SDP同源基因（命名为Tl SDP,Ct SDP1,Ct SDP2和Ct SDP3）的生物学功能。通过利用KLG和GGFL作为唯一氮源的培养实验,本研究首先证实该四个同源SDP蛋白的寡肽转运活性。不仅如此,Tl SDP和Ct SDP两个蛋白还具有谷胱甘肽（GSH）转运活性,显示了其非特异性双重转运活性。此外,SDP基因参与了嗜热真菌的生殖生长调控:Tl SDP缺失降低疏棉状嗜热丝孢菌的产孢量,单独缺失Ct SDP1-3会不同程度减少嗜热毛壳菌的有性生殖结构的数量,阻碍闭囊壳和子囊孢子的形成。为进一步研究Tl SDP与Ct SDPs四个同源基因功能上的相关性,本研究基于疏棉状嗜热丝孢菌Tl SDP缺失突变体（ΔTl SDP）构建了分别由Ct SDP1-3基因互补的转化子。研究发现,无论是Ct SDPs的单基因互补,或是多基因互补都能够不同程度的恢复ΔTl SDP的产孢缺陷,恢复ΔTl SDP的生长速率,孢子萌发率和芽管伸长等表型,特别是还能使疏棉状嗜热丝孢菌菌丝形成勾状或绕圈状的类有性生殖结构,说明毛壳菌SDP基因区别于疏棉状嗜热丝孢菌SDP,具有特异的有性生殖调控特性。单孢菌丝持续生长实验发现,SDP基因还与嗜热真菌的寿命相关,缺失Tl SDP基因导致疏棉状嗜热丝孢菌寿命延长,除Ct SDP2外,Ct SDP1,3在疏棉状嗜热丝孢菌中表达均能恢复该表型。此外,本研究在Ct SDP2序列中,鉴定了一段由72个核苷酸组成的特异性插入序列（72INS）,该序列可能与有性生殖起始相关,也是导致Ct SDP2和其它Ct SDPs功能差异的原因。综上所述,本研究利用分子遗传学技术鉴定了嗜热真菌ANXC7和SDP两类生长与发育相关基因。ANXC7和Tl SDP均参与调控疏棉状嗜热丝孢菌生长发育和对胁迫的应答,特别是参与调控了分生孢子的形成,萌发和脱落。此外,本研究全面解析了4个性别分化过程蛋白基因的生物学功能。证实以有性生殖为主要发育方式的嗜热毛壳的Ct SDPs基因不仅具有Tl SDP的特性,而且参与调控嗜热丝孢菌的缺陷表型,还产生了类有性生殖结构,揭示了Ct SDPs参与调控嗜热菌的有性生殖。此外,发现Ct SDP2的插入序列片段72INS参与有性生殖起始调控。本研究从生长发育和适应角度探讨了ANXC7和SDPs基因的生物功能,研究结果为进一步揭示嗜热菌的发育、生存和进化奠定了基础,也为嗜热丝孢菌的高效利用提供了理论证据。