研究背景:胶质瘤是成人最常见的原发性颅内肿瘤,是一种异质性、侵袭性肿瘤,预后不良。在过去几十年中,中国人群中恶性脑瘤的发病率迅速上升,尤其是在大城市。许多环境和生活方式因素均与胶质瘤的易感性密切相关,例如职业、电离辐射、手机辐射、吸烟和饮食等。同时,遗传因素对胶质瘤的发生起着更为重要的影响。全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS)发现一些基因位点的异常与胶质瘤有关,例如5p13.33(TERT),8q24.21(CCDC26),9p21.3(CDKN2A/B),11q23.3(PHLDB1)和20q13.33(RTEL1)等。Pleckstrin同源性结构域B族成员1(pleckstrin homology-like domain family B member 1,PHLDB1)是一种首先在生物信息学屏幕上识别的蛋白质。近年来,大量研究分析了PHLDB1基因多态性与包括胶质瘤在内的多种疾病存在显著关系。其中,位于PHLDB1基因的5’非翻译区的rs498872与胶质瘤关系的研究最多。在神经母细胞瘤中11q23.3区域通常会缺失,这表明该基因在脑肿瘤中的重要作用。本研究将通过人群数据和细胞实验分析PHLDB1基因在胶质瘤发生和进展中的作用,进而为胶质瘤的诊治提供理论依据。第一部分PHLDB1rs498872多态性与胶质瘤易感性的荟萃分析目的:为了更好地了解rs498872多态性变体对胶质瘤风险的影响,我们对所有已发表的病例对照研究进行了荟萃分析,以探讨rs498872多态性与胶质瘤易感性的关联。方法:Pub Med,Web of Science和Embase Pub Med网站上通过以下检索词对纳入的文章进行检索:“pleckstrin homology-like domain family B member 1”,“PHLDB1”,“11q23.3”,“rs498872”,“polymorphism”,“variant”,“variation”,“mutation”,“genotype”,“allele”和“glioma”。检索起始时间为从数据库建库至2018年12月。我们使用纽卡斯-渥太华量表(Newcastle-Ottawa scale,NOS)来评估合格研究的质量。使用Begger方法绘制漏斗图来检测纳入文献的发表偏移。使用Review Manager 5.3.3版本进行统计分析。结果:1.共有12项符合条件的研究被纳入分析,12项病例对照研究共包括11482例病例和24782例对照。2.在显性模型(CC与CT+TT)中,CC基因型能显著降低胶质瘤的易感性(P<0.0001,OR=0.81,95%CI为0.76-0.85);在隐性模型中(TT与CC+CT),TT基因型能显著增加胶质瘤的易感性(P<0.0001,OR=1.23,95%CI=1.13-1.34);共显性模型(TT与CC)结果显示,CT基因型能显著增加胶质瘤的易感性(P<0.0001,OR=1.15,95%CI=1.09-1.21)。等位基因C与T比较结果显示,等位基因C能显著降低胶质瘤的易感性(P<0.0001,OR=0.86,95%CI=0.84-0.90)。进一步的亚组分析结果显示,在亚洲人和高加索人中得出的阳性结果与总的分析结果相似。3.在所有比较中,汇总分析中发现的显著相关性保持不变,这表明我们的发现在统计上是稳定的,总体结果比较稳固和可靠。4.漏斗图的形状在每次比较中都是对称的,这表明我们纳入的文献没有严重的发表偏差。结论:我们的荟萃分析表明,TT基因型能显著增加胶质瘤的易感性,rs498872多态性可能是亚洲人和白种人胶质瘤的潜在遗传生物标志物。第二部分PHLDB1rs498872多态性在胶质瘤患者中的临床意义目的:在人群数据中,分析rs498872多态性与胶质瘤进展和预后的关系,并进一步分析rs498872多态性与主要环境因素和其它胶质瘤相关多态性位点的交互作用。方法:2012年1月至2017年12月在我院收集胶质瘤患者400例。同期,在我院收集健康对照480例。在病例收集期间,每天去我院检验科收集初诊为胶质瘤的患者和健康对照人群的血样,保存于4℃冰箱。在医院HIS病例查询系统中,查询患者的初诊时肿瘤大小、肿瘤位置、分期和Ki-67值等病理特征资料。采用问卷调查的方式获取研究对象的主要影响因素包括性别、年龄、文化程度、吸烟、饮酒、工作类型、癌症家族史、手机使用频率和放射治疗等。自确诊时起,对所有研究对象定期随访,随访间隔为4周。采用聚合酶链式反应-连接酶检测反应(Polymerase Chain ReactionLipase Detection Reaction,PCR-LDR)检测基因多态性。结果:1.rs498872多态性基因型分为CC、CT和TT三种,病例组CC基因型较多,对照组TT基因型较多。病例组的T等位基因频率显著高于对照组(P﹤0.05)。相对于CC基因型,TT基因型能显著增加胶质瘤的患病风险(P﹤0.05),TT+CT基因型能显著增加胶质瘤的患病风险(P﹤0.05)。在等位基因的分析结果中,相对于等位基因C,等位基因T能显著增加胶质瘤的患病风险(P﹤0.05)。2.CC基因型在肿瘤小于5cm、Ⅱ+Ⅲ期、Ki-67值≦10、KPS评分≥80的胶质瘤患者中分布频率较高,TT基因型在肿瘤≥5cm、Ⅳ期、Ki-67值﹥10、KPS评分﹤70的胶质瘤患者中分布频率较高。3.TT、CT和CC三种基因型胶质瘤患者的中位生存期分别是23.5、27.3和32.1个月,三组患者的生存期差异有统计学意义(卡方值=14.86,P=0.001),TT基因型患者的生存期最短、CC基因型患者的生存期最长。分期Ⅳ、肿瘤大小大于5cm、Ki-67值﹥10、KPS评分﹤70、累及多个脑叶、TT基因型是胶质瘤预后的独立危险因素。4.CC、CT和TT三种基因型患者的1年复发率分别是48(34.8%)、54(39.1%)和36(26.1%),差异有统计学意义(卡方值=6.18,P﹤0.05)。TT基因型能显著增加胶质瘤患者1年内复发的风险(P﹤0.05)。5.家族史、吸烟、放射治疗史、职业暴露小于10年和职业暴露大于10年均是胶质瘤发病的独立危险因素(P﹤0.05)。rs498872和家族史在影响胶质瘤发生中不存在显著交互作用,rs498872和吸烟、放射治疗史、职业暴露史在影响胶质瘤发生中存在显著正向交互作用。6.XRCC1Arg194Trp、XRCC1 Arg399Gln、ERCC1 C8092A、ERCC2 Lys751Gln和MGMT Leu84Phe位点中的突变纯合子均能显著增加胶质瘤的易感性。rs498872和XRCC1Arg194Trp、MGMT Leu84Phe位点在影响胶质瘤易感性中存在正向交互作用。结论:rs498872多态性位点的杂合子和突变纯合子能显著增加胶质瘤的易感性。同时,rs498872多态性位点与胶质瘤的临床特征相关,rs498872多态性位点的TT基因型是胶质瘤预后和复发的独立危险因素。吸烟、放射治疗史、职业暴露、XRCC1Arg194Trp、MGMT Leu84Phe和rs498872多态性在影响胶质瘤易感性方面存在正向交互作用。第三部分PHLDB1蛋白表达对胶质瘤细胞生物学功能的影响目的:分析PHLDB1蛋白异常表达对胶质瘤细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响,并在胶质瘤细胞中分析其对PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响。方法:人星形胶质细胞HA、人胶质瘤细胞系U251、U87和SHG-44购买于中国医学科学院基础医学研究所。U251和SHG-44细胞分别分为空白组、空载组、PHLDB1抑制组、PHLDB1过表达组。空白组细胞不作处理,空载组、PHLDB1抑制组、PHLDB1过表达组分别转染空载质粒、PHLDB1抑制质粒和PHLDB1过表达质粒。分别使用CCK8法、Transwell实验、流式法和划痕实验检测胶质瘤细胞的增殖能力、侵袭能力、凋亡水平和迁移能力。免疫蛋白印迹方法检测PHLDB1和p-Akt蛋白在胶质瘤细胞中的相对表达水平。RT-PCR检测细胞中PHLDB1 m RNA水平。结果:1.PHLDB1蛋白在人星形胶质细胞HA、人胶质瘤细胞系U251、U87和SHG-44中的相对表达水平分别是0.87±0.24、1.78±0.35、1.83±0.21和2.04?0.32。PHLDB1m RNA在人星形胶质细胞HA、人胶质瘤细胞系U251、U87和SHG-44中的相对表达水平分别是1.08±0.15、2.04±0.51、1.97±0.35和2.41?0.55。Nthy-ori3-1细胞中PHLDB1蛋白和m RNA水平显著低于人胶质瘤细胞系U251、U87和SHG-44(P<0.05)。2.U251和SHG-44细胞中PHLDB1蛋白和m RNA在空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组细胞中的相对表达水平均差异具有统计学意义(P<0.05)。PHLDB1抑制组的PHLDB1蛋白和m RNA相对表达水平显著低于空白组和空载组(P<0.05);PHLDB1过表达组的PHLDB1蛋白和m RNA相对表达水平显著高于空白组和空载组(P<0.05)。3.在U251细胞中,空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组中细胞增殖倍数分别是4.23±1.02、3.94±1.12、1.81±0.58和7.56±2.01。在SHG-44细胞中,空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组中细胞增殖倍数分别是5.51±1.03、5.06±2.14、3.21±1.08和7.53±2.19。PHLDB1抑制组细胞增殖倍数显著低于空白组和空载组,PHLDB1过表达组细胞增殖倍数显著高于空白组和空载组。4.在U251细胞中,空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组中穿膜细胞数分别是241±53.6、286±49.3、108±21.6和352±75.2。在SHG-44细胞中,空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组中穿膜细胞数分别是305±53.2、296±41.8、207±63.4和396±53.1。PHLDB1抑制组穿膜细胞数显著低于空白组和空载组,PHLDB1过表达组细胞增殖倍数显著高于空白组和空载组。5.在U251细胞中,空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组细胞的愈合率分别是12.3±3.29、14.6±4.05、8.12±2.05和26.3±5.23。在SHG-44细胞中,空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组细胞的愈合率分别是16.3±2.54、18.5±4.21、9.12±2.41和31.0±5.19。PHLDB1抑制组细胞的愈合率显著低于空白组和空载组,PHLDB1过表达组细胞的愈合率显著高于空白组和空载组。6.在U251细胞中,空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组细胞的凋亡率分别是18.9±4.25、20.5±3.96、39.6±8.21和10.3±3.05。在SHG-44细胞中,空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组细胞的凋亡率分别是12.6±2.36、13.5±2.15、27.5±3.69和6.34±1.54。PHLDB1抑制组细胞的凋亡率显著高于空白组和空载组,PHLDB1过表达组细胞的凋亡率显著低于空白组和空载组。7.在胶质瘤细胞U251中,p-Akt蛋白在空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组中的相对表达水平分别是1.12?0.21、1.05?0.23、0.54?0.15和2.18?0.41。在胶质瘤细胞SHG-44中,p-Akt蛋白在空白组、空载组、PHLDB1抑制组和PHLDB1过表达组中的相对表达水平分别是0.93?0.24、1.14?0.30、0.48?0.11和1.91?0.38。PHLDB1抑制组细胞中的pAkt蛋白相对表达水平显著低于空白组和空载组,PHLDB1过表达组细胞中的p-Akt蛋白相对表达水平显著高于空白组和空载组。结论:PHLDB1基因抑制能抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进胶质瘤细胞的凋亡,反之,能促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并抑制胶质瘤细胞的凋亡。PHLDB1基因过表达使p-Akt蛋白表达水平升高,提示PHLDB1对PI3K/Akt信号通路有激活作用。