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天疱疮是以抗钙黏素为自身抗原的自身免疫性皮肤病,该病的发生与机体产生致病性抗桥粒芯糖蛋白(DSG)1及抗DSG3为代表的抗桥粒成分自身抗体有关。近年随着分子生物学的飞速发展,对天疱疮的发病机制也进行了深入研究,但在研究过程中却出现诸多限制,这些限制主要来源于研究对象的选择。以临床患者作为研究对象涉及伦理道德问题及人道主义问题；缺乏足够的动物模型,已有动物模型维护价格高昂；离体细胞模型资料少且混乱。在上述限制下,本研究拟通过寻找合适的角质形成细胞(KC)及合适的条件,为天疱疮的离体研究提供一种良好的可重复、简单的实验对象。作为皮肤科慢性、重症疾病,天疱疮发病中自身抗体引起KC出现棘层松解的病理生理学机制目前并未完全阐明,DSG补偿理论、空间效应理论、信号转导理论这三大主流理论各有利弊,而我们前期研究结果显示患者乙酰胆碱受体(AchR)自身抗体的存在及部分DSG3自身抗体阳性天疱疮患者KC AchR特别是m3毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAchR)的变化,这一结果提示抗DSG3自身抗体与AchR特别是m3mAchR之存在一定的相互作用或影响。因此本研究拟通过更改KC培养条件阐明常见不同亚型天疱疮患者血清对KC m3mAchR影响。第1章桥粒芯糖蛋白1、桥粒芯糖蛋白3在不同角质形成细胞的表达目的测定不同类型KC (HaCat细胞、A431细胞及原代KC) DSG1、DSG3及DSG1信使核糖核酸(mRNA)、DSG3mRNA表达；方法不同KC培养后,直接免疫荧光(DIF)观察细胞表而DSG1、DSG3的分布,定量多聚酶链反应(qPCR)测定DSG1mRNA、DSG3mRNA相对表达水平；结果三种KC表而均有DSG1与DSG3连续性表达；蛋白荧光强度示A431细胞表而DSG1、DSG3表达高于HaCat细胞,而HaCat细胞又高于原代KC；成纤维细胞(FB)不表达DSG1与DSG3；原代KC表达DSG1与DSG3mRNA的量高于HaCat细胞,A431细胞DSG1与DSG3mRNA相对表达量低于HaCat细胞；结论三种KC均可用于对DSG1、DSG3进行相关研究；但相对而言,A431细胞更适合于单独进行DSG1、DSG3翻译水平研究,原代KC更合适于单独进行转录水平研究,HaCat细胞更适用于需同时进行转录水平与翻译水平研究。第2章不同融合状态影响角质形成细胞桥粒芯糖蛋白1、桥粒芯糖蛋白3表达目的测定不同融合状态下HaCat细胞DSG1、DSG3及DSG1mRNA、DSG3mRNA表达差异；方法培养HaCat细胞后以不同细胞数量倍增接种培养,DIF结合激光共聚焦三维成像观察细胞表而DSG1、DSG3的表达,qPCR测定DSG1mRNA、 DSG3mRNA相对表达水平；结果细胞分裂时,细胞膜交界处DSG1荧光增加强度较DSG3更为明显；随着细胞数目增加及接触增多,DSG1、DSG3荧光在交界处均明显增强；HaCat细胞融合数在10%至40%区间内DSG1mRNA表达量呈上升趋势,而在80%至100%区间呈下降趋势；DSG3mRNA则在细胞融合数为20%至80%区间表达量呈上升趋势；细胞100%融合后,融合初始DSG1mRNA、DSG3mRNA呈现明显的低表达,完全融合后DSG1mRNA表达增加,DSG3mRNA无明显变化；结论观察DSG1、DSG3蛋白需要在细胞融合一定程度后进行；DSG1mRNA、DSG3mRNA的测定在10%至40%区间或80%至100%区间受细胞融合状态的影响更小；DSG3mRNA的测定在20%至80%区间受细胞融合状态的影响更小。第3章常见不同亚型天疱疮患者血清影响角质形成细胞桥粒芯糖蛋白3表达目的测定常见不同临床亚型天疱疮患者血清对HaCat细胞DSG3及DSG3mRNA表达的影响：方法采集部分常见临床亚型天疱疮患者血清,酶联免疫吸附测定(ELISA)测定抗DSG1自身抗体、抗DSG3自身抗体滴度后,与HaCat细胞共同培养,DIF观察细胞表而DSG3的荧光强度变化,qPCR测定DSG3mRNA表达变化；结果入选的寻常型天疱疮患者血清抗DSG1抗体、抗DSG3抗体均阳性,副肿瘤型天疱疮患者血清抗DSG3抗体阳性,落叶型天疱疮患者血清抗DSG1抗体阳性；三种患者血清均可使离体培养HaCat细胞集落“收缩”,而均对集落内细胞形态影响不明显；三种患者血清均能降低HaCat钏胞表而DSG3荧光强度；抗DSG1抗体、抗DSG3抗体双阳性的寻常型天疱疮患者血清及抗DSG3P目性的副肿瘤天疱疮患者血清作用增加HaCat细胞DSG3mRNA表达；抗DSG1抗体阳性的落叶型天疱疮患者血清显著降低HaCat细胞DSG3mRNA表达；结论寻常型、副肿瘤、落叶型天疱疮患者血清均对单个HaCat细胞形态影响不明显但可影响HaCat钏胞集落的生物学行为；若不考虑除血清中其他物质的影响,发现抗DSG3抗体阳性血清可以降低HaCat细胞表而DSG3荧光强度,但增加HaCat细胞DSG3mRNA表达；单抗DSG1抗体血清降低HaCat细胞表而DSG3荧光强度及DSG3mRNA表达。第4章毒蕈碱型乙酰胆碱受体通路影响角质形成细胞桥粒芯糖蛋白3表达目的测定1mAchR通路对HaCat钏胞DSG3及L)SG3mRNA表达的影响；方法细胞培养后以噻唑蓝(MTT)法测定不同时间、不同浓度氯化乙酰胆碱(Ach)及硫酸阿托品(Atr)对HaCat细胞活力的影响；选择不影响HaCat细胞活力的试剂浓度作用细胞后,DIF观察细胞表而DSG3荧光强度变化,qPCR测定LDSG3mRNA表达变化；结果高浓度(10-2M) Atr显著杀伤HaCat细胞,次高浓度(10-3M、10-4M)Atr显著降低HaCat细胞活力；高浓度(10-2M)Ach在6h、12h增加HaCat细胞的活力,10-5～10-6M Atr及10-3M Ach不影响HaCat细胞活力：1O-5M Atr作用6h、12h后HaCat细胞表而及细胞连接处DSG3荧光强度降低,10-3M Ach作用6h、12h后分别增加及降低HaCat钏胞表而及钏胞连接处DSG3荧光强度；10-5M Atr作用2h、12h显著降低HaCat细胞DSG3mRNA表达；10-3M Ach作用6h增加HaCat细胞DSG3mRNA表达,而作用2h、12h均明显抑制HaCat细胞DSG3mRNA表达；结论高浓度Atr与Ach分别降低与增加HaCat细胞活力。mAchR激动剂及mAchR拮抗剂短期(12h以内)对DSG3的表达影响不一,长期(12h以上)存在均可在转录与翻译水平,使HaCat细胞DSG3表达降低。第5章常见不同亚型天疱疮患者血清影响角质形成细胞m3毒草碱型乙酰胆碱受体mRNA表达目的测定常见不同临床亚型天疱疮患者血清对]HaCat细胞1m3mAchR表达的影响；方法采集部分常见临床亚型天疱疮患者血清,ELISA测定抗DSG1自身抗体、抗DSG3自身抗体滴度后,与HaCat细胞共同培养,DIF观察细胞表面m3mAchR的荧光强度变化,qPCR测定CHRM3mRNA表达变化；结果三种患者血清作用后m3mAchR荧光强度未出现明显变化；抗DSG1抗体、抗DSG3抗体双阳性的寻常型天疱疮患者血清及抗DSG3阳性的副肿瘤天疱疮患者血清作用增加HaCat细胞CHRM3mRNA表达；抗DSG1抗体阳性的落叶型天疱疮患者血清显著降低HaCat细胞CHRM3mRNA表达；结论天疱疮患者血清对HaCat细胞m3mAchR荧光强度影响不明显；若不考虑除血清中其他物质的影响,抗DSG3抗体阳性血清可以增加HaCat细胞CHRM3mRNA表达。