论文部分内容阅读
目的：
1．构建野生型烟酸受体GPR109a、C末端4个缺失体和C末端的点突变体。
2．寻找对GPR109a受体内吞起关键作用的磷酸化位点。
3．分析突变体对受体胞内信号传导的影响。
方法：
1．提取人基因组并PCR扩增烟酸受体GPR109a基因，构建到载体pEGFP-N1。
2．分别构建烟酸受体GPR109a的C末端Δ295-314，Δ315-326，Δ327-343，△344-363四个缺失体，并检测各缺失体的膜定位和内吞情况。
3．利用重叠PCR技术构建烟酸受体GPR109a C末端点突变体GPR109a(T318A)、GPR109a(S326A)、GPR109a(T327A)、GPR109a(T332A)和GPR109a(T338A)。
4．利用检测胞内第二信使cAMP变化和蛋白免疫印迹(Western Blotting)的方法观察各突变体下游信号转导的变化情况。
结果：
1．缺失体Δ295-314主要存在于细胞质内，不能定位到细胞膜上，主要是定位于内质网。
2．缺失体Δ315-326和△327-343在配体刺激后不能够发生内吞。
3．点突变体GPR109a(S326A)、GPR109a(T327A)在配体刺激后不能够发生内吞。
4．点突变体GPR109a(S326A)、GPR109a(S327A)不影响胞内第二信使cAMP信号的改变。
5．缺失体Δ315-326和点突变体GPR109a(S326A)、GPR109a(S327A)不影响胞内下游ERK1/2磷酸化的水平。
结论：
1．烟酸受体GPR109a第295-314位的氨基酸序列YFSSPSFPNF影响了受体从内质网装运至细胞膜的过程
2．烟酸受体GPR109a C末端第326位丝氨酸和第327位苏氨酸是GRK2磷酸化受体的关键位点。
3．烟酸受体GPR109a C末端GRK2磷酸化位点的改变(如点突变体GPR109a(S326A)、GPR109a(S327A))仅能构成细胞受体内吞和信号脱敏的改变，并不影响受体所偶联的Gi蛋白介导的下游信号转导途径。