背景和目的Peutz-Jephers综合征(Peutz-Jeghers syndrome,PJS)是以多发性错构瘤样胃肠道息肉和皮肤粘膜色素沉着为主要临床表现,并具有高度肿瘤易感性的常染色体显性遗传性疾病,其临床发病率约为1/120000-1/8300之间。抑癌基因LKB1(Liver Kinase B1)/STK11被公认为PJS的主要致病基因。STK11基因突变导致的LKB1蛋白激酶失活可引起包括PJ综合征的多种疾病的发生。目前,在PJ综合征和散发肿瘤中已经检测出200多种STK11基因突变。世界范围内,STK11新突变不断有报道,这进一步丰富了STK11基因的突变谱,为STK11基因型与表型关系的研究提供有利的平台,也为患者遗传咨询、产前诊断及随访计划等奠定基础。LKB1/STK11作为一种抑癌基因,先前研究已发现其可通过调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞极性、染色质重构及能量代谢等方面对肿瘤的发生发展起至关重要的作用。然而,LKB1确切的致病机制错综复杂,至今未能完全阐明,而不同的STK11基因突变可能通过作用于细胞功能活动的不同环节导致疾病发生。因此,本课题拟归纳PJ综合征患者临床资料,并通过对患者及其家属进行LKB1/STK11基因胚系突变筛查以丰富PJS患者基因突变谱,为进一步分析PJS基因型和临床表型的关系奠定基础；同时构建STK11基因新突变表达质粒,研究其对细胞增殖、细胞凋亡及其下游信号表达等的影响,并进一步验证突变是否为该PJS家系的致病性突变。材料和方法1、主要材料DNA提取试剂盒,MLPA试剂盒,Hela、SW1116、DLD1、HT29、SW620、 SW480、LOVO、colo205、HCT116细胞,Lipofectamine2000Reagent, Trizol, RIPA Buffer,细胞凋亡试剂盒,CCK8Reagent, LKB1, P-AMPK(Thr172)、 P70S6K(Thr389),P-AKT (Ser473), VEGF, PCNA,β-actin, GAPDH等抗体。2、方法1) STK11引物设计利用NCBI基因数据库查找STK11基因的全长编码序列。参考文献直接引用文献引物序列及用Primer3.0自行设计扩增STK11基因的引物,并摸索引物反应条件。2)PJS患者STK11基因胚系突变检测收集来自广州市南方医科大学南方医院的来自9个家系的12个PJS患者及其家属的血液、息肉标本,同时收集南方医院体检中心50位正常人血液作为正常对照组。提取PJS先证者血液基因组DNA, PCR扩增后纯化回收产物,通过DNA直接测序法检测STK11基因的胚系突变,利用HGMD、NCBI数据库在线BLAST比对进行初步筛查后,突变者基因分别与其家系健康人及正常对照组DNA序列比较,并参考NCBI dbSNP数据库,排除单核苷酸多态性可能。对于DNA直接测序法未能检测出突变者,采用MLPA技术进行基因大片段缺失或重复检测,利用GeneMarker(?) HID STR Human Identity Software分析结果。3)LKB1质粒的构建及鉴定空载体质粒pGCMV-GFP-Vecor、野生型质粒pGCMV-GFP-LKB1(WT)及突变型质粒pGCMV-GFP-LKB1(G288R)由上海吉玛公司构建,经过测序再次鉴定。4)LKB1在不同肿瘤细胞中的表达Hela、SW1116、DLD1、HT29、SW620、SW480、LOVO、colo205、HCT116细胞常规培养于37℃,5%C02的恒温培养箱中。分别用Trizol裂解,通过RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction,逆转录-聚合酶链式反应)检测细胞中LKB1mRNA基本表达水平；利用RIPA buffer(已加蛋白酶抑制剂)裂解不同肿瘤细胞,用蛋白印迹法(Western Blot)检测细胞中LKB1蛋白的基本表达水平。比较不同肿瘤细胞中LKB1表达,并选取表达水平较低或者不表达的细胞株进行后续实验。5)LKB1质粒瞬时转染Hela, SW1116细胞后LKB1mRNA和蛋白的表达Hela细胞常规传代均匀铺于十二孔板内,待长至约70-80%,分别予pGCMV-GFP-Vector、pGCMV-GFP-LKB1(WT)和pGCMV-GFP-LKB1(G288R)质粒通过Lipofectamine2000脂质体介导转染Hela. SW1116细胞,转染4-6小时后换液,48小时后提取细胞总mRNA及总蛋白,检测并比较LKB1在不同转染组细胞中mRNA和蛋白表达的差异。6)LKB1质粒转染Hela细胞、SW1116细胞后对细胞增殖活性的影响常规培养Hela, SW1116细胞,并用100ul RPIM1640完全培养基含5000个细胞/孔(Hela细胞)铺于96孔板内,次日分别转染空载体质粒pGCMV-GFP-Vecor,野生型质粒pGCMV-GFP-LKB1(WT)及突变型质粒pGCMV-GFP-LKB1(G288R),48小时后各加入10ul/孔CCK-8试剂检测450nnM波长下各孔细胞的吸光值,比较不同质粒转染后对细胞增殖活性的影响。7)LKB1质粒转染SW1116细胞后对细胞克隆形成能力的影响细胞铺于12孔板内,同上瞬时转染SW1116细胞后,消化各个转染组细胞,离心后重悬,计数并每孔取4000个细胞分别溶于各1.5m10.35%琼脂混合液中,混匀后铺于已凝固的0.5%软琼脂的6孔板内,每组设3个复孔,待其凝固,37℃培养箱中常规培养两周后,0.05%结晶紫染色,PBS洗涤后镜下观察,计数并拍照。比较转染不同质粒对细胞克隆形成能力的影响。8)LKB1质粒转染Hela、SW1116细胞后对细胞凋亡的影响三种质粒分别转染Hela、SW1116细胞48小时后,消化细胞,800rpm,离心5min,冷PBS洗两次；1*Binding Buffer重悬细胞,使细胞浓度约1*106cells/ml;取100ul(1*105cells)上述重悬液至5ml EP管中；加入5ul FITC AnnexinV和5ul PI溶液；温柔摇匀细胞,25℃,避光,15min后加入400ul1*Binding Buffer混匀,行流式细胞检测,并比较不同组细胞凋亡率的差异。9)LKB1质粒转染Hela,SW1116细胞后对LKB1/AMPK/mTOR信号通路及对磷酸化蛋白P-AKT(Ser473)表达的影响细胞铺于12孔板内,同上瞬时转染Hela、SW1116细胞,转染48小时并饥饿12小时后RIPA Buffer(已加蛋白酶抑制剂)裂解细胞,检测并比较不同转染组细胞中LKB1/AMPK/mTOR信号通路蛋白、PCNA蛋白表达：另外,不同质粒转染细胞48小时并饥饿12小时后,裂解前5min予胰岛素(50nM)刺激细胞,检测并比较不同处理组P-AKT(Ser473)蛋白的表达水平。10)数据统计利用SPSS13.0软件分析数据,不同组结果利用one way ANOVA统计方法分析,方差齐者采用LSD、Bonferroni方法比较,方差不齐者则采用Dunnett T3方法为准比较。采用“算术平均值士标准差(geometric means±standard deviation, M±S.D)"来表示数据,以P值<0.05视为有显著性差异。结果1、以正常人及家系健康人DNA作对照,来自9个家系的12例PJS患者中检测出7种STK1l基因突变,DNA直接测序法发现的突变包括3种点突变(错义突变),1种单碱基插入,1种小片段缺失,MLPA技术检测有2个家系分别发生STK1l基因第1号和第3号外显子的大片段缺失,均预测可能引起编码蛋白表达或功能的异常。其中1例点突变为新突变,未曾在现有数据库及既往文献中报道；该新突变使STK11基因上第六号外显子的第862个位点由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A),导致LKB1蛋白激酶活性区域的第288个氨基酸由GGG(G,甘氨酸)变为AGG(R,精氨酸)。2、RT-PCR和western blot检测Hela细胞与SW1116细胞中几乎不表达LKB1mRNA及其蛋白,SW1116细胞的基因中未发现这种新突变。3、RT-PCR和western blot检测Hela、SW1116细胞转染LKB1质粒后,与空白载体转染组相比,野生型和突变型质粒转染组细胞中LKB1mRNA和蛋白的水平明显上调,且表达量相当(P>0.05)。4、对转染LKB1质粒的Hela及SW1116细胞进行CCK8(Cell counting Kit8)检测发现,与空载体转染组细胞和突变型质粒转染组细胞相比,转染野生型LKB1质粒细胞于450nm波长处吸光值(0D450)明显降低(P<0.01),而空载体组与突变组之间OD450值无统计学差异(P>0.05),即野生型组细胞增殖活性降低。5、LKB1质粒转染SW1116细胞后进行软琼脂克隆形成实验发现,与转染空载体组和突变型质粒组的细胞克隆数量相比,转染野生型LKB1质粒组细胞克隆数量下降超过50%,具有统计学差异(P<0.01)；而空载体组与突变组之间无明显差异(P>0.05),即野生型转染组细胞克隆形成能力明显降低。6、流式细胞术检测Hela细胞的细胞凋亡率发现,野生型转染组细胞凋亡率(Annexin V-FITC阳性者即总凋亡率为20.78±2.32%；Annexin V-FITC阳性并PI阴性者即早期凋亡率为16.46±2.09%)与突变型转染组细胞凋亡率(20.30±2.87；16.67±2.21%)无明显差异(P>0.05),而两组细胞凋亡率较空白对照组(7.67±1.65%；4.43±0.60%)明显升高(P<0.01)；同样,SW1116细胞进行流式细胞术检测发现,野生型转染组细胞凋亡率(Annexin V-FITC阳性者即总凋亡率为21.70±2.07%; Annexin V-FITC阳性并PI阴性者即早期凋亡率为16.74±1.63%)与突变型转染组细胞凋亡率(20.96±2.95%；15.62±1.93%)无明显差异(P>0.05),而两组细胞凋亡率较空白对照组(13.97±1.63%；9.46±1.15%)明显升高(P<0.01)。说明新突变可能不影响LKB1对细胞凋亡的促进作用。7、与空载体和突变型质粒转染组细胞相比,转染野生型LKB1质粒的细胞由AMPK蛋白的Thr172位点磷酸化水平升高(P<0.01),其下游信号蛋白P70S6K于Thr389位点的磷酸化水平降低(P<0.01),而VEGF、PCNA、P-AKT(Ser473)蛋白表达水平则明显降低(P<0.01)。结论1、LKB1/STK11基因胚系突变可导致PJ综合征的发生,9个PJS家系中发现的7种突变均为致病性突变；PJS患者中的STK11突变c.862G>A,即p.288G>R,为新发现的LKB1/STK11基因胚系突变；2、首次采用结肠腺癌细胞SW1116进行LKB1基因突变的功能研究,发现G288R对LKB1mRNA及蛋白量的表达无影响,提示该突变可能不影响LKB1基因的转录与翻译过程；3、G288R部分或全部失去LKB1抑制细胞增殖的能力,而对LKB1促进细胞凋亡可能无明显影响；4、G288R失去磷酸化激活AMPK的能力,使下游mTOR异常活化,提示新突变降低了LKB1蛋白的激酶活性。因此,LKB1/STK11是PJ综合征的致病基因,LKB1/STK11基因新突变G288R可明显改变细胞功能,其潜在机制可能主要通过降低了LKB1蛋白的激酶活性,影响多种相关蛋白表达,进而促进细胞增殖,引起PJ综合征的发生。新突变G288R为该PJS家系的致病性突变。