目的:构建结核分枝杆菌重组亚单位C-R-N疫苗;皮下免疫,观察该疫苗的免疫原性和免疫保护性。方法:PCR法分别扩增出结核分枝杆菌Mtb32A羧基端编码序列（Mtb32_C）、Mtb32A氨基端编码序列（不包含分泌肽编码序列,Mtb32_N）和Rv2660c基因,通过Overlap PCR扩增出Mtb32_C-Rv2660c-Mtb32_N（C-R-N）融合基因。将扩增的基因分别克隆至质粒p ET32a（+）,构建重组质粒,测序验证。重组质粒转化至E.coli BL21中,1m M IPTG诱导表达,超声碎菌,离心后收集上清及沉淀,亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot检测蛋白的表达及纯化。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为5组,分别为PBS组、BCG组、Mtb32A（Mtb32_C+Mtb32_N）组、Rv2660c组和C-R-N融合蛋白组,每组15只,共75只。将纯化的蛋白以1:1的比例与不完全弗式佐剂充分乳化,50μg/只（不超过200μL）皮下免疫小鼠,每两周一次,共免疫三次,末次免疫两周后,每组处死10只小鼠,收集小鼠血清和脾细胞,通过ELISA检测细胞因子IL-2和IFN-γ,并检测抗体Ig G、Ig G1和Ig G2a,计算Ig G2a/Ig G1;使用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖;采用流式细胞术检测CD₄⁺T/CD₈⁺T细胞比值等反映疫苗的免疫原性。末次免疫三周后,将BCG以4×10⁴/只（不超过200μL）低剂量尾静脉攻击剩余小鼠,三周后处死小鼠,收集小鼠肺脏和血清,通过病理变化和血清中Th1细胞因子水平观察疫苗对小鼠的保护效果。结果:经测序鉴定,成功构建重组质粒p ET32a（+）-C-R-N,经SDS-PAGE和Western-blot检测显示目的条带大小约为57.1k Da,与预期相符。ELISA检测C-R-N组免疫小鼠血清中Th1型细胞因子IL-2水平与BCG组无差异,而IFN-γ水平显著高于BCG组（P<0.05）;C-R-N组脾细胞分泌的IFN-γ水平略低于BCG组;血清中Ig G2a/Ig G1<1;C-R-N组淋巴细胞中的CD₄⁺T/CD₈⁺T细胞比值高于BCG组;C-R-N组淋巴细胞增殖略低于BCG组。低剂量BCG攻击免疫小鼠后,通过病理切片分析得知,C-R-N组肺泡完好,无炎性渗透或肉芽肿形成;Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ水平与BCG相当。结论:亚单位疫苗C-R-N诱导了偏Th2型细胞免疫反应,具有一定的免疫原性,并一定程度上能保护小鼠抵抗分枝杆菌的攻击。