背景右归饮来源于《景岳全书·卷五十一》,由熟地黄、枸杞子、山茱萸、山药、附子、肉桂、杜仲、甘草8味中药组成,功效阴阳双补,填精补血,主治命门不足,肾精亏虚证,是著名的经典名方。右归饮临床应用广泛,药理作用研究较多,但右归饮中到底含有哪些化学成分,其安全性如何,尚未见系统报道。右归饮亦是本课题组主攻领域——“肾精”的生物物质基础及其作用机制阐释,和“补肾益精”方药治疗“肾精亏虚证”的药理作用机制阐释的工具药物。右归饮的药物组成,涵盖了不同极性、多个种类的化合物成分,分析和鉴定这些化学成分,是控制该方实验用药质量和阐明其药理作用物质基础的关键环节。故而,研究右归饮的化学成分和安全性具有重要意义。本研究得到重庆市科委-计生委中医药科研重点项目(zy201801001)“右归饮治疗肾精亏虚证核心功效物质组及其证候蛋白组学阐释”的支持。目的1.定性分析右归饮复方的化学成分,并定量检测其中的指标性成分和主要活性成分;2.评价右归饮的急性毒性和长期毒性。方法1.两种供试品的制备①右归饮水煎液的制备:按处方组成称取8种生药材加水8倍,煎煮2次,每次0.5 h,合并药液,浓缩至2 g·mL-1生药质量浓度,-4℃储存备用。②右归饮配方颗粒液的制备:按剂量折算,称取8种药物的配方颗粒混合,加43 mL水,加热(75℃),配制成1.9 g·mL-1生药质量浓度,即得。③样品的制备:分别量取上述右归饮水煎液和配方颗粒液0.1ml,稀释100倍(正离子模式检测)或1000倍(负离子模式检测),超声,离心,吸取上清液,即得。2.右归饮化学成分的定性分析方法①色谱条件:采用waters,ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100 mm,1.7μm)进行分离,流动相为0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱,正负离子模式下采集数据。②定性检测方法:采用UPLC-QTOF-MS/MS对右归饮水煎液和配方颗粒液中的化学成分进行定性,并利用一级质谱确定相对分子量,二级质谱获得裂解信息,结合标准品或文献数据比较确定化学结构。3.右归饮化学成分的定量分析方法①定量成分的选择:将水煎液与配方颗粒液定性分析获得的共有成分进行网络药理学作用预测,取预测结果中主要药理作用所对应的成分,以及2015年版《中国药典》指标性成分,作为定量待测成分。②色谱条件:采用 waters,ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱(2.1×100 mm,1.7μm)进行分离,流动相为0.1%甲酸乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水(B),梯度洗脱,采用电喷雾离子源,正负离子模式下采集数据。③定量检测方法:采用UPLC-QqQ-MS/MS对右归饮水煎液和配方颗粒液中的这18个化学成分进行含量测定。4.右归饮急性毒性试验:1)分组及给药:将KM小鼠随机分为空白组和给药组,每组10只,给药组灌胃给予240 g·kg-1右归饮配方颗粒液,0.04 ml·10g-1/只/次,一天3次,共720 g·kg-1,相当于人临床用量的533倍。2)观察指标:①外观形态:观察一般体征,活动状态、每周体重。②脏器组织:脑、胸腺、心、脾、胃、肺、肾脏外观并计算其脏器指数。③血常规指标:用血细胞分析仪检测全血中WBC、HGB、MCH、MCHC、HCT、MCV和PLT的含量。④肝功能指标:用全自动血液生化仪测定血清中ALT、AST、ALP、TP、GLU、T-CHO和TG的含量。⑤肾功能指标:用全自动血液生化仪测定血清中CREA、UREA和CK的含量。5.右归饮长期毒性试验:1)分组与给药:将SD大鼠随机分为空白组和给药组,每组60只,给药组灌胃给予60 g·kg-1右归饮配方颗粒液,相当于人临床用量的45倍,一天1次,连续90 d,1 mL·100g-1/只/次,给药结束后,恢复期观察30 d。2)观察指标:①外观形态:观察一般体征,活动状态、每周体重。②脏器组织:脑、胸腺、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃、卵巢、子宫、附睾、睾丸外观形态,计算脏器指数:石蜡切片HE染色观察其组织形态学。③血常规指标:用血细胞分析仪检测全血中HGB、RBC、HCT、MCH、MCHC和PLT的含量。④肝功能指标:用全自动血液生化仪测定血清中AST、ALP、ALB、TP、GLU、TG和T-CHO的含量。⑤肾功能指标:用全自动血液生化仪测定血清中CREA、UREA和CK的含量。结果1.右归饮化学成分的定性 1)右归饮水煎液的定性:①确定了右归饮水煎液中80个质谱峰的药材来源。②确定了右归饮水煎液中85个化学成分的结构。其中,源于山茱萸的有7个环烯醚萜类和2个鞣质类成分;源于枸杞子的有3个苯丙素类和5个黄酮类成分;源于杜仲的有1个环烯醚萜类和7个木脂素类成分;源于肉桂的有1个苯丙素类成分;源于熟地黄的有6个苯丙素类和6个环烯醚萜类成分;源于炙甘草的有2个苯丙素类、8个黄酮类和18个三萜皂苷类成分;源于制附子的有19个生物碱类成分。2)右归饮配方颗粒液的定性:①确定了右归饮配方颗粒液中232个质谱峰的药材来源。②确定了右归饮配方颗粒液中29个化学成分的结构。其中,源于山茱萸的有3个环烯醚萜类和1个鞣质类成分;源于枸杞子的有2个黄酮类成分;源于杜仲的有2个木脂素类成分;源于肉桂的有2个苯丙素类;源于熟地黄的有2个苯丙素类成分;源于炙甘草的有1个黄酮类和4个三萜皂苷类成分;源于制附子的有12个生物碱类成分。2.右归饮两种剂型定量成分的选择①网络药理学预测结果,治疗骨质疏松症的药效成分有28个:槐果碱、宋果灵、类叶升麻苷、异类叶升麻苷、马钱苷、甘草苷、甘草酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、没食子酸、肉桂醛等。②右归饮水煎液和配方颗粒液中已确定结构的化学成分共有16个:乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、肉桂醛、类叶升麻苷、异类叶升麻苷、莫诺苷、马钱苷、甘草苷、甘草酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、新乌头原碱。前15个为2015年《药典》含量测定的指标性成分。3.右归饮化学成分的定量分析 利用多反应监测模式(MRM)可以同时检测右归饮水煎液和配方颗粒液中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头原碱、宋果灵、槐果碱、肉桂醛、甘草酸、松脂醇二葡萄糖苷、异类叶升麻苷、类叶升麻苷、莫诺苷、马钱苷、甘草苷、京尼平苷酸18个化学成分的含量,专属性、线性(r≥0.9947)、重复性(≤1.08%)、精密度(≤1.34%)、稳定性(≤1.73%)和平均回收率(89.49～106.67%)方法学验证指标符合2015年《中国药典》的含量测定要求。4.右归饮配方颗粒液最大给药量灌胃未见KM小鼠出现显著急性毒性反应 与空白组相比,右归饮720 g·kg-1组小鼠有如下变化:①右归饮组小鼠一般体征正常,均未出现中毒现象;体重增加无显著性变化(*P>0.05);②右归饮组小鼠脑、心、脾等主要脏器的外观及脏器指数均无显著性改变(*P>0.05);③右归饮组小鼠的血常规指标WBC、HGB、MCH、MCHC、HCT、MCV和PLT,无统计学差异(*P>0.05);④右归饮组小鼠肝功能指标ALT、AST、ALP、TP、GLU、T-CHO和TG的含量均无显著性变化(*P>0.05);⑤右归饮组小鼠肾功能指标CREA、UREA和CK的含量均无显著性变化(*P>0.05)。5.右归饮配方颗粒液灌胃给药90 d及停药再恢复30 d未见SD大鼠有显著长期毒性反应 与空白组相比,右归饮60 g·kg-1组大鼠有如下变化:①右归饮组大鼠的动物一般体征均无异常变化,也无大鼠死亡;大鼠每周体重无显著性差异;②主要脏器的大体形态学及脏器指数均无显著性改变;③血常规指标HGB、RBC、HCT、MCH、MCHC和PLT,无统计学差异;④给药90 d及停药恢复30 d后,右归饮组血清中肝功能指标ALT、AST、ALP、ALB、TP、TG、GLU和T-CHO的含量均无显著性差异;恢复30 d后,血清中肝功能指标ALT、AST、ALP、TP、GLU和T-CHO的含量显著降低;⑤右归饮组血清中肾功能指标CREA的含量均无显著性差异,给药90 d及恢复30 d后,UREA显著降低,给药90 d后,CK显著增加,恢复30 d后,CK显著性降低(均*P<0.05),但都在正常大鼠的生理范围内。结论1.经UPLC-QTOF-MS/MS定性检测,右归饮水煎液中至少含85个结构明确的化学成分,右归饮配方颗粒液中至少含29个结构明确的化学成分,二者共有16个化学成分。2.所建立的UPLC-QqQ-MS/MS的定量检测方法,能同时快速检测出右归饮水煎液或配方颗粒液中15个预测的药效成分(其中8个指标性成分)和3个毒性成分的含量。3.急性毒性与长期性毒性试验显示右归饮配方颗粒液口服临床安全性较高。