论文部分内容阅读
传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney NecrosisVirus,ISKNV)属于肿大细胞病毒属，是造成养殖鳜鱼爆发性死亡的主要病原，给我国的水产养殖带来巨大的损失。越来越多的研究表明，线粒体在病毒感染过程中扮演着重要角色，甚至在病毒感染后引起的细胞凋亡中起着重要作用。本文选取了ISKNV编码的VP005L和VP092R这两个病毒蛋白进行功能研究。运用激光共聚焦技术、亚细胞定位技术以及线粒体各组分的特异性标志酶作为内参等实验，确定这两个基因定位于FHM细胞的线粒体。采用JC-1试剂结合流式细胞仪，检测转染pcDNA3.1-V5/His-005后细胞膜电位的改变，与对照pcDNA3.1-V5/His相比，转染pcDNA3.1-V5/His-005细胞的膜电位明显下降，得出VP005L具有促进细胞凋亡的作用。利用Annexin-V/PI试剂结合流式细胞仪，检测转染pcDNA3.1-V5/His-005后细胞的早期凋亡率，与对照相比，转染pcDNA3.1-V5/His-005后细胞的早期凋亡率明显高于对照组，这也证明VP005L具有促进细胞凋亡的作用。运用dsRNA技术将感染ISKNV病毒后表达的VP005L基因沉默，结合Annexin-V/PI试剂检测早期凋亡率，实验组dsRNA-005的早期凋亡率低于对照组。用荧光定量技术检测转染pcDNA3.1-V5/His-005后相关凋亡基因的表达水平，与对照相比，在转染48h时，VP005L对caspase3基因的表达有轻微的上调作用，上调了1.12倍，对Bcl-2基因有下调作用，下调了1.30倍,对Bax基因有上调作用，上调了1.38倍。这说明VP005L参与的是Bcl-2调控的线粒体途径的凋亡，通过下调抑凋亡基因Bcl-2的表达，上调促凋亡基因Bax的表达来起作用。本实验室卢清侠得出VP092R与mthsp70蛋白相互作用，在此研究的基础上，我们进一步研究VP092R的功能。用G418筛选的B16-92细胞系和对照组B16-pc细胞系分别注射C57小鼠，发现实验组的成瘤体积和速度远远高于对照组，得出VP092R具有促进肿瘤生长的作用。用放线菌素D(ACD)诱导筛选好的B16-92细胞系，利用Annexin-V/PI试剂结合流式细胞仪检测早期凋亡率，得出实验组的早期凋亡率明显低于对照组。运用dsRNA技术将感染ISKNV病毒后表达的VP092R基因沉默，结合Annexin-V/PI试剂检测早期凋亡率，实验组dsRNA-92的早期凋亡率高于对照组。用荧光定量技术检测转染VP092R后相关凋亡基因的表达水平，在加药后24h,与对照相比，VP092R对caspase3基因的表达有轻微的上调作用，对Bcl-2基因有上调作用，上调了3.43倍，对Bax基因和Bak基因有下调作用，分别下调了2.89倍和1.87倍，这说明VP092R上调了Bcl-2调控的线粒体途径的凋亡。最后，转染VP092R24h后加入ACD诱导凋亡，用westernblotting检测相关凋亡基因的表达水平，与对照组相比，实验组中P53，Bak蛋白的表达水平明显下降，mthsp70蛋白的表达水平上升，而caspase3,caspase9蛋白的表达水平不变，得出VP092R参与的是内源性凋亡通路，与P53和mthsp70的调控相关，而与外源性凋亡通路也就是caspase家族介导的凋亡通路无关。我们通过研究发现，本文选取的两个定位于宿主的线粒体蛋白参与P53基因调控的细胞凋亡，这也为探索病毒感染与宿主相互作用机制奠定了基础。