目的:熟地黄作为常用滋补类中药之一,据统计它的使用频率在中药处方中排名处于前10位,是临床使用最频繁的中药材之一。本文以熟地黄药效研究为出发点,分析、比较地黄不同炮制加工工艺(九蒸九晒工艺,九蒸九烘工艺,现代法炮制工艺),建立了不同炮制工艺熟地黄的双波长指纹图谱,HPLC法检测毛蕊花糖苷、五羟甲基糠醛(5-HMF)的含量,熟地黄多糖的化学成分差异以及熟地黄主要成分的LC-MS鉴定,并结合药效学结果,测试了其主要成分对大鼠卵巢颗粒细胞的药理活性。该实验结果为不同炮制工艺熟地黄的药效差异提供理论依据,为临床熟地黄饮片炮制的质量提供一定的参考数据。方法:1.熟地黄不同炮制工艺研究在查阅相关文献基础上,结合实验室前期对熟地黄炮制方法的探讨、分析,制定了三种熟地黄的炮制工艺法,分别是九蒸九晒炮制法(古法炮制),九蒸九烘炮制法,现代法炮制(一次性蒸制法),以此标准进一步对熟地黄的成分展开研究。2.熟地黄多糖含量和单糖组成测定方法的建立熟地黄多糖采用水提醇沉法提取,用经典苯酚-硫酸法对其多糖含量进行测定,并进行方法学考察。熟地黄多糖的单糖组成采用气相色谱法进行分析,其升温程序为:120℃保持3 min,以3℃/min升温至180℃,再以2℃/min升温至210℃,保持4min。进样体积1.0μl,气体流速1.0 ml/min,进样口温度250℃,检测器温度280℃,柱温210℃,空气、氮气及氢气流速为分别为400、25及30 ml/min,分流比为1:20,建立熟地黄多糖的单糖组成测定方法,并进行方法学考察。3.熟地黄主要成分双波长指纹图谱分析及含量测定分别准确量取一蒸一晒～九蒸九晒,一蒸一烘～九蒸九烘,现代法炮制熟地黄5.00 g制备熟地黄水提液,加无水乙醇至含醇量为80%除去糖类物质干扰,采用高效液相色谱法测定不同炮制工艺熟地黄的成分,并使用双波长指纹图谱分析法(205 nm,284nm)最大化呈现三种炮制工艺熟地黄主要成分的动态变化趋势,其色谱条件为:流动相乙腈(A相)和0.02%甲酸水(B相)梯度洗脱,梯度洗脱程序为0～5 min,1%～1.5%A,5～12 min,1.5%～3%A,12～17 min,3%～7%A,17～50 min,7%～9.5%A,50～70 min,9.5%～18%A,70～10.0 min,18%～21%A,流速为1 ml/min;并制备毛蕊花糖苷及5-HMF的标准曲线测定其含量,采用LC-MS分析指纹图谱的特征峰成分,并进行方法学考察。4.熟地黄主要成分给药大鼠卵巢颗粒细胞的活性研究分别提取九蒸九晒、九蒸九烘及现代法炮制工艺的熟地黄总多糖。建立雌性大鼠卵巢颗粒细胞模型,并将上述不同工艺熟地黄多糖分别配成浓度为25、50、75、100、150、200、250、300、400 μg/ml的梯度多糖溶液给予细胞,培养24 h后MTT法检测不同炮制工艺熟地黄多糖对大鼠卵巢颗粒细胞的增殖的影响。并用SPSS 20.0统计软件进行分析,运用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.熟地黄不同炮制工艺研究制定了三种炮制方法炮制地黄,本研究所用九蒸九晒熟地黄为隔水清蒸6 h,次日早上10点晒至下午5点为一次性蒸晒,反复八次达到九蒸九晒的目的。现代法炮制熟地黄参照《广东省中药炮制规范2005版》:取生地黄,洗净,润软,蒸12h,停火取出,烘置八成干,切厚片,晾干。另外,本次研究结合古法和现代法炮制,首次提出九蒸九烘熟地黄,取生地隔水清蒸6 h,放置60℃烘箱烘4 h作为一次蒸烘,如此反复八次达到九蒸九烘熟地黄。2.熟地黄多糖含量和单糖组成测定方法的建立采用经典苯酚-硫酸法测定三种炮制工艺地黄的总多糖含量,其中九蒸九晒炮制地黄总多糖含量最多,占总药材(20.00 g提取)含量的1.625%。按气相色谱条件下各色谱峰分离度较好,理论塔板数均大于5000,三种炮制品均含有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸、鼠李糖,但不同炮制工艺的熟地黄多糖其单糖摩尔比各不相同,九蒸九晒熟地黄多糖中各种单糖的成分较均衡,6 种单糖的摩尔比为 Rha:Ara:Man:Glc:Gal:GalA=0.62:0.41:0.72:1.00:3.83:0.61。3.熟地黄主要成分双波长指纹图谱分析及含量测定按上文色谱条件进行测定,根据高效液相色谱分析在205 nm和284 nm下各选取1个色谱峰,构建熟地黄HPLC色谱图的特征指纹图谱。将指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版”,以S1样品图谱作为相似度计算校正的参照谱,采用中位数法生成对照图谱,205 nm波长中一蒸一晒～九蒸九晒的相似度计算结果在0.507～0.954之间,284 nm波长中一蒸一晒～九蒸九晒的相似度计算结果在0.002～0.999之间,205 nm波长下一蒸一烘～九蒸九烘相似度计算结果在0.201～0.970之间,284 nm波长中一蒸一烘～九蒸九烘的相似度计算结果在0.001～0.999之间,可知生地黄在九蒸九晒和九蒸九烘炮制工艺过程中化学成分是动态的变化,在炮制前后化学成分含量差异显著,其次,波长在284 nm比205 nm变异更加显著。在主含量测定方面从生地黄炮制成九蒸九晒或九蒸九烘熟地黄过程中5-HMF含量是逐渐增大到趋于稳定的变化,九蒸九晒及九蒸九烘熟地黄5-HMF含量较现代法炮制熟地黄多出近1倍,其中九蒸九晒熟地黄含量最多。另一成分毛蕊花糖苷在生地黄经过不同方法炮制后其含量逐渐减少,现代法及九蒸九晒熟地黄的毛蕊花糖苷含量符合药典规定,其中九蒸九晒熟地黄含量最多,但九蒸九烘熟地黄的毛蕊花糖苷含量大幅锐减。为进一步确认熟地黄提取物中共有峰的化学成分,通过UPLC-AB Sciex Triple TOF 5600+飞行时间液质联用仪,使用负离子扫描模式,可获得熟地黄提取物指纹图谱中共有峰对应化合物的结构和性质,双波长选取的十个共有峰依次为乙酰丙酸、肉苁蓉苷F、地黄素C、5-HMF、黑蒴苷、松果菊苷、焦地黄苯乙醇苷A、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B、异毛蕊花糖苷。4.熟地黄主要成分给药大鼠卵巢颗粒细胞的活性研究MTT法结果显示,卵巢颗粒细胞在不同熟地黄多糖作用下增殖效果各不相同,有一定的量效关系,当浓度为150 μg/ml时其增殖效果最显著,且九蒸九晒熟地多糖>九蒸九烘熟地多糖>现代法熟地多糖>生地黄多糖,在浓度为100,150,200μg/ml与对照组相比均有统计学意义(P<0.05);另一方面,当浓度为200 μg/ml时九蒸九晒熟地多糖与现代法熟地多糖给药卵巢颗粒细胞后组间差异明显(P<0.05),这提示九蒸九晒熟地黄的炮制效果更佳,因为不同分子量多糖进入机体内消化代谢均不同,分子量较大的多糖难以吸收,从结果可得九蒸九晒熟地黄多糖作用效果更显著,这也从侧面反映九蒸九晒熟地黄具有较好的物质药效基础。