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附睾是家畜生殖系统中的重要器官之一,负责精子的成熟、转运和储存。附睾功能的实现依赖于其旺盛的生理活性,因而自由基的产生是不可避免的。自由基过度积累或缺乏氧化酶势必造成附睾氧化应激,引起精子质膜及其DNA发生氧化损伤,极大地影响精子运动和受精能力,从而造成公畜繁殖能力的下降。谷胱甘肽过氧化酶家族(GPx)的主要功能是维持公畜生殖道内自由基正常水平,能够有效保护精子。因此,本研究以绵羊为研究模型,探讨GPx5基因在绵羊附睾上的时空表达特性及雄激素对绵羊附睾GPx5基因表达的影响,并在体外构建绵羊附睾上皮细胞系,在细胞水平上对GPx5基因的表达模式进行研究。利用RNAi技术,在转录水平上初步鉴定GPx5基因的抗氧化机制。本研究成果一方面可以从分子水平上诠释GPx5时空特异性表达调控的机制,另一方面可以为组织特异表达基因的分子调控机制的研究提供新思路,同时可丰富家畜繁殖生理学的分子调控理论。经上述试验,得到如下研究结果：1.采用荧光定量PCR技术、免疫印迹技术及免疫荧光法检测GPx5基因在不同发育期绵羊附睾不同部位上的mRNA和蛋白水平表达及分布定位。荧光定量PCR结果表明,8月龄羊附睾头部GPx5基因mRNA表达量显著高于体部和尾部(P<0.05);同时其表达量显著高于2月龄羊和5岁羊附睾头部(P<0.05)。经RT-PCR鉴定,绵羊精子上表达GPx5基因。免疫印迹结果表明,2月龄羊附睾中未检测到GPx5蛋白表达；在8月龄羊附睾不同部位均有表达,而5岁羊附睾头部和体部表达,尾部无表达。进一步,灰度分析结果表明,8月龄羊附睾头部GPx5表达量显著高于其它部位(P<0.05),且表达量也显著高于5岁羊附睾头部(P<0.05)。免疫荧光结果表明,在2月龄羊附睾未检测到GPx5蛋白表达信号；8月龄羊附睾不同部位均有荧光信号表达,且头和体部荧光强度明显高于附睾尾部,同时在附睾管液体中也发现有荧光信号；5岁羊附睾头部和体部有荧光信号,且荧光信号遍布于附睾管假复层上皮细胞的细胞核和细胞质中；附睾精子膜上检测到荧光信号。GPx5基因mRNA在绵羊不同发育时期附睾中均有表达,但在附睾不同部位表达确有差异；GPx5蛋白在附睾管假复层上皮细胞内表达,但2月龄羊和5岁羊附睾尾部不表达,由此推测,GPx5的蛋白表达与绵羊性机能发育有密切关联。2.利用酶联免疫吸附(ELISA)、实时荧光定量PCR和免疫印迹法,研究雄激素对绵羊附睾特异性表达基因GPx5的影响。ELISA结果表明,用丙酸睾酮处理公羊后其血清、附睾的二氢睾酮(DHT)、雄激素受体(AR)及附睾睾酮(T)含量均显著提高(P<0.05)；实时荧光定量PCR结果表明,丙酸睾酮处理组与对照组相比,GPx5mRNA表达量显著提高(P<0.05)；免疫印迹结果表明,处理组附睾GPx5蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)。由此推测,绵羊附睾特异性基因GPx5的表达受雄激素的调控。3.采用机械剪切结合酶消化法,成功建立了绵羊附睾上皮细胞系,体外生长时呈扁平不规则多角,细胞生长曲线呈“S”型。采用RT-PCR法和免疫荧光法,检测附睾上皮细胞GPx5基因mRNA和GPx5、角蛋白(CK18)表达。免疫荧光结果显示,细胞间紧密相连形成单层膜,呈现鹅卵石样排列；上皮细胞中均检测到CK18和GPx5蛋白的荧光信号。经RT-PCR鉴定,绵羊附睾上皮细胞表达GPx5基因。4.采用RNA干扰和重组腺病毒技术,沉默绵羊附睾上皮细胞GPx5基因表达,再用Ad5/F35MaxTM重组腺病毒系统,将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的包装质粒共转染包装细胞,借助Cre/loxP系统的作用重组产生腺病毒。将设计好的寡聚GPx5 shRNA经退火复性后插入穿梭质粒pHBAd-U6-Scramble-CMV-GFP中。设计3组靶向GPx5基因shRNA干扰序列,并分别构建3组GPx5 shRNA1、GPx5 shRNA2、GPx5 shRNA3腺病毒载体,并转染HEK293细胞,通过包装、扩增后产生干扰重组腺病毒AD-GPx5 shRNA 1、AD-GPx5 shRNA2、AD-GPx5 shRNA3, TCID50法测定其滴度分别为1×1010PFU/ml、1.26x1010PFU/ml,1.58×1010PFU/ml。用AD-GPx5 shRNA感染上皮细胞(MOI=100),实时定量PCR检测表明,在病毒感染24 h和36h,绵羊附睾上皮细胞中GPx5 mRNA表达量在AD-GPx5 shRNA1、AD-GPx5 shRNA2和AD-GPx5 shRNA3感染后分别显著下调了42%、40%、44%和65%、75%、73%(P<0.05),其中AD-GPx5 shRNA2和AD-GPx5 shRNA3的干扰效果最佳,检测SOD活力,细胞GSH含量结果表明AD-GPx5 shRNA2组与AD-GFP组相比较显著提高(P<0.05)。因此在后续的试验中可用AD-GPx5 shRNA2干扰载体,并且GPx5基因表达量减少引起其他氧化因子的增多。