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目的以HSP70与PreS1的相互作用为基础,以HSP70参与调控HBV病毒分泌作为研究对象,阐明HSP70在包浆内引导HBV病毒颗粒向细胞膜转运和分泌的机制,同时为开发以阻断HBV分泌的新型抗病毒药奠定基础。方法1)分子克隆技术构建pW28-HSP70原核表达质粒,在大肠杆菌(Eecherichia coli,E.coli)B834中获得可溶性上清表达,通过蛋白纯化技术纯化。分子克隆技术构建HSP70腺病毒,构建稳定表达HSP70的肝癌细胞系。2)构建PreS1截断片段质粒,获得GST-PreS1X1,GST-PreS1X2,GST-PreS1X3融合蛋白,Pull down实验初步探究HSP70与PreS1的结合位点。3)进一步将PreS1截断为氨基酸残基,获得GST-PreS1Δ1-13,GST-PreS1Δ1-44,GST-PreS1Δ16-27,GST-PreS1Δ21-33,GS T-PreS1-Δ21-47,GST-PreS1Δ31-47,GST-PreS1Δ41-53融合蛋白,通过微量热泳动技术(Microscale Thermophoresis,MST)找出在HSP70与PreS1在相互结合中发挥重要作用的位点。4)通过定点突变技术获得hsp70突变体,表达纯化突变型蛋白。孔雀绿定磷法检测野生型及突变型hsp70的atpase活性。5)通过qrt-pcr,westernblot检测肝癌细胞系中hbv对hsp70的影响;检测hsp70对hbv的转录及蛋白表达水平的影响。6)通过qrt-pcr,westernblot,elisa检测hsp70在hepg2.2.15及ad38细胞系中,对hbv分泌水平的影响。7)通过高通量测序筛选与hbv分泌相关因子探究hbv分泌相关机制。结果1)pw28-hsp70重组质粒在e.coli中获得可溶性上清表达。经纯化hsp70蛋白纯度达85%以上。成功构建pad-hsp70重组腺病毒,并在hepg2.2.15中稳定表达。2)获得纯度90%以上的gst-pres1x1,gst-pres1x2,gst-pres1x3融合蛋白,pulldown实验证实hsp70蛋白能够与gst-pres1x1,gst-pres1x2,gst-pres1x3蛋白分别结合。3)pres1的30-45个氨基酸残基在与hsp70的结合中起着关键作用。4)获得三种突变型hsp70蛋白,分别为mutant-thr38,mutant-thr229,mutant-ser300。野生型hsp70蛋白的atpase在37℃,tris–hcl(ph8.0)等条件下具有较好的活性。野生型hsp70蛋白atpase活性显著高于突变体,其检测结果具有统计学意义。5)qrt-pcr结果显示,hbv可以引起hsp70mrna水平增高,western blot显示HBV可以引起HSP70蛋白表达增加;同时HSP70可以抑制HBV的转录水平,HSP70降低HBV蛋白表达水平。6)qRT-PCR,western blot及ELISA结果显示HSP70在一定程度上增加了表达HBV的肝癌细胞中HBV分泌量。7)高通量测序筛选出部分与HBV分泌相关因子。结论PreS1的30-45氨基酸在与HSP70的结合过程中发挥重要作用;HSP70具有ATPase活性;HSP70能够介导HBV分泌。