研究背景及研究目的在哺乳动物中,功能性卵母细胞的形成需要经历复杂的生长过程,通常被称作卵母细胞成熟,包括减数分裂的恢复和大量细胞质以及细胞核修饰的发生。这一过程对形成高质量的卵母细胞至关重要。多方面的遗传和环境因素可调节卵母细胞的成熟,从而影响卵母细胞的质量和发育能力。卵母细胞质量是女性生育能力的关键限制因素,影响着单精子受精、早期胚胎生存和植入、妊娠维持、胎儿发育甚至疾病的发生。在卵子发生过程中,卵母细胞受多种基因调控,这些基因组成复杂的调控网络来决定卵母细胞的形态和质量。异常的基因表达通常导致卵母细胞中线粒体功能紊乱、纺锤体结构畸形或皮质颗粒(CGs)的分布异常等,从而降低卵母细胞的发育潜能,进而影响胚胎的质量。刺激型异源三聚体Gs蛋白α亚基(Gsα)是一种广泛表达的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,可通过和多种受体偶联来调节细胞内cAMP信号通路,进而参与调控细胞的生命活动。在小鼠卵巢中,Gsα在卵母细胞中以高水平表达,定位于卵母细胞膜和细胞质中,并且在卵泡颗粒细胞中表达量较低。据报道,Gsα通过在卵母细胞内合成cAMP来抑制未成熟哺乳动物卵母细胞的减数分裂恢复。向小鼠卵母细胞胞质中注射抑制Gsα的抗体或者显性失活形式的Gsα可导致完整卵泡中的卵母细胞自发恢复减数分裂。在卵母细胞中,Gs偶联受体GPR3激活Gsα。GPR3基因敲除导致小鼠卵巢中减数分裂的提前恢复,并降低老年小鼠的生育力。腺昔酸环化酶3(AC3)是卵母细胞中Gsα激活的主要同种型,并产生cAMP以维持减数分裂停滞。AC3全敲的小鼠也表现出了卵泡中的卵母细胞减数分裂提前恢复以及雌性生育力下降的表型。因此,我们认为Gsα信号通路不仅被需要用于维持哺乳动物卵母细胞减数分裂阻滞,而且对雌性生育力的维持也非常重要。尽管体外实验已经证明Gsα能够在哺乳动物卵母细胞中维持减数分裂阻滞。然而Gsα在体内对于卵子发生和卵母细胞发育能力的作用依然未知。由于Gsα全敲的突变小鼠在胚胎期死亡,于是我们利用条件性基因敲除技术,使用Zp3-Cre/LoxP系统构建了 Gsα卵母细胞特异性敲除小鼠来研究Gsα在卵母细胞发育中的作用。拟解决的科学问题本论文主要研究以下问题:(1)Gsα对雌性生育力的影响(2)Gsα对卵子发生和卵母细胞发育能力的调控作用(3)Gsα影响卵母细胞质量的可能分子机制研究方法及取得的成果为探究上述的科研问题,本论文以小鼠为模式动物,通过Cre-LoxP系统,首先构建了卵母细胞特异性敲除Gsα的小鼠模型,即Zp3-Gssα条件敲除小鼠。Zp3-Cre在初级卵泡以及后续的卵泡发育时期的卵母细胞中都表达,我们可以通过Zp3-Gsα条件敲除小鼠来研究Gsα对卵泡发育和卵母细胞减数分裂成熟的作用。Zp3-Gsα条件敲除小鼠的雌性可以存活,与野生型的小鼠相比无明显的生长,活动和发育异常。为了研究在卵母细胞中敲除Gsα对雌性小鼠生育力的影响,我们进行了繁殖实验,通过与可育的野生型公鼠长达六个月以上的繁殖实验我们发现,敲除小鼠完全不育。通过自然排卵分析发现Zp3-Gsα条件敲除小鼠排卵正常且排卵数量与野生型小鼠无明显差别。敲除小鼠和野生型小鼠的两侧卵巢重量也无显著差异。同时,我们对卵巢进行了组织形态分析,发现在成年的Zp3-Gsα条件敲除小鼠卵巢中存在各个不同发育时期的卵泡。为了进一步研究Gsα敲除对于卵泡发育的影响,我们对不同年龄的小鼠进行了卵泡计数。结果显示2月龄的敲除小鼠卵巢各个时期的卵泡数量正常,但6月龄的敲除小鼠出现了卵巢中激活卵泡数量下降的现象。由于Zp3-Cre在原始卵泡中不表达,我们没有观察到老年敲除小鼠中原始卵泡数量的异常。但生长卵泡数量的明显下降表明Gsα可能在老年小鼠的卵泡发育中起到维护作用,有助于保护老年雌性小鼠的功能性卵巢储备。尽管Gsα敲除导致了卵泡发育异常,但这并非是导致雌性小鼠不育的关键因素。我们对Zp3-Gsα条件敲除小鼠形成的胚胎进行了检测,发现在胚胎期第五天敲除小鼠子宫内没有成功植入的胚胎,进一步检测发现植入前的胚胎发育出现了严重缺陷。与野生型小鼠相比,Zp3-Gsα条件敲除小鼠的卵母细胞受精能力明显降低,形成合子的概率对比野生型明显下降,一些敲除小鼠的卵母细胞即使受精成功,也无法观察到可见的原核,通过免疫荧光发现这些合子表现出有效原核形成的缺陷。Zp3-Gsα条件敲除小鼠后续的胚胎发育也受到影响,这些胚胎停滞在2-细胞期,或者在植入前的发育期间退化,并且没有胚胎可发育至囊胚期。由此我们认为早期胚胎发育能力受损直接导致了 Zp3-Gsα条件敲除的雌性小鼠不育。为了进一步研究由Gsα敲除导致的卵母细胞发育能力缺陷,我们检测了卵母细胞成熟和卵母细胞质量。通过卵巢穿刺收集小鼠窦状卵泡中的卵母细胞,并进行体外培养。我们发现当Zp3-Gsα条件敲除小鼠的卵母细胞从卵巢中分离时,已经有部分卵母细胞出现了减数分裂提前恢复,GV期的卵母细胞比例相对于野生型明显下降,这验证了 Gsα在小鼠体内对于卵母细胞减数分裂阻滞的调控作用。除此之外,我们发现相比野生型小鼠,敲除小鼠卵母细胞的退化率显著提高。经过卵母细胞体外成熟培养后,敲除小鼠中只有部分卵母细胞发生恢复减数分裂,对比野生型小鼠明显降低。我们观察到在培养过程中,敲除小鼠卵母细胞的退化率逐渐增高,这可能是导致敲除小鼠卵母细胞体外成熟率下降的原因。上述结果表明,,卵母细胞中Gsα的缺乏不仅导致卵母细胞的减数分裂不同步,而且还损害了卵母细胞的减数分裂能力。随后,我们对小鼠MII期卵母细胞进行了形态分析。通过自然排卵发现,成年ZP3-Gsα条件敲除小鼠排卵量与野生型小鼠类似,但是卵母细胞形态异常的概率明显上升。通过超排卵显示,敲除小鼠的卵母细胞形态异常的概率进一步提高。因此,我们认为卵母细胞中敲除Gsα显著影响了卵母细胞质量。为进一步分析Gsα敲除的卵母细胞质量,我们用免疫荧光检测了卵母细胞的纺锤体结构和皮质颗粒的分布。对比野生型小鼠,Zp3-Gsα条件敲除小鼠表现出了较高比率的纺锤体结构异常,以及染色体排列不齐。并且与野生型小鼠相比,敲除小鼠的卵母细胞出现局部皮质颗粒提前外排的现象明显增多。上述细胞结构的异常,也证明了Gsα敲除导致了小鼠卵母细胞质量的恶化。为判断卵母细胞质量的下降是否与氧化应激有关,我们进一步检测了细胞内活性氧(ROS)水平,以及细胞内抗氧化剂还原型谷胱甘肽(GSH)的含量。我们发现不论在GV期还是在MiI期,Zp3-Gsα条件敲除小鼠的卵母细胞中ROS水平比野生型小鼠明显升高。并且与野生型小鼠相比,Zp3-Gsα条件敲除小鼠MII期卵母细胞中GSH的水平以及GSH/GSSG的比值都显著下降。这表明缺乏Gsα的卵母细胞中出现了氧化应激。通过对线粒体参数的检测,我们发现Zp3-Gsα条件敲除小鼠的卵母细胞线粒体分布异常,线粒体DNA拷贝数和线粒体膜电势相比野生型小鼠也显著降低。对ATP水平进行检测后发现,敲除小鼠卵母细胞胃中ATP的含量相对野生型明显下降。通过Annexin-V染色,我们发现敲除小鼠的卵母细胞发生了早期凋亡。随后用抗氧化剂NAC对敲除小鼠卵母细胞进行处理,我们发现NAC的增补显著提高了敲除小鼠卵母细胞的发育能力,受精率和卵裂率增高,部分胚胎形成了囊胚,在一定程度上补救了 Gsα删除导致的卵母细胞质量和发育能力的缺陷。由此我们推测,氧化应激可能是Gsα敲除小鼠卵母细胞质量恶化和导致雌性不育的主要原因。综上所述,Gsα在小鼠卵母细胞的发育过程中发挥重要作用,参与调控卵母细胞减数分裂状态,卵母细胞的成熟,维持卵母细胞质量,影响早期胚胎发育能力。Gsα缺失引起卵母细胞中出现氧化应激,线粒体功能紊乱和细胞凋亡。通过靶向Gsα信号通路可能有助于在临床上预防和治疗女性不孕症。研究意义尽管Gsα在体外研究中被报道调控哺乳动物卵母细胞减数分裂阻滞,在体内条件下Gsα对雌性生育力的确切作用却知之甚少。在本论文中,我们利用Gsα卵母细胞特异性敲除小鼠模型来研究了 Gsα对卵子发生、受精和早期胚胎发育的功能。我们首次发现了卵母细胞特异性删除Gsα导致雌性小鼠完全不孕,而氧化应激在这一过程中起着重要作用。缺失Gsα导致卵母细胞质量恶化,早期胚胎发育能力受损。与此同时,增补抗氧化剂可以部分挽救缺乏Gsα导致的卵母细胞缺陷。本论文研究了体内条件下Gsα在小鼠卵母细胞发育中的功能,我们认为这对于配子发生和受精的研究具有重要意义。论文中制作的Gsα特异性敲除小鼠模型可作为人类女性不育的动物模型,为治疗女性不育症提供理论基础和治疗方向。