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胚胎干细胞(Embryonic stem cell,简称ES细胞),是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团(Inner cell mass, ICM)或原始生殖细胞(Primordial germcell, PGCs)中分离出来,经体外分化抑制培养获得的具有无限增殖能力和保持未分化状态的细胞系。该细胞系具有胚胎细胞与普通培养细胞的双重特性,其具有正常的二倍体核型,具有发育的全能性和多能性,并可无限增殖、冷冻保存及进行基因遗传操作。牛作为家畜中重要的动物,其ES细胞的建立具有广阔的应用前景。如何克服牛ES细胞建系中存在的问题,找到适合牛ES细胞生长增殖的环境已成为现在亟待解决的问题。本研究比较了饲养层的种类和密度、胚胎的处理方法及不同培养液对牛类胚胎干细胞培养的影响,并采用DDRT-PCR和Western blotting技术从mRNA水平和蛋白质水平上观察了不同形态和不同代次牛类胚胎干细胞基因表达的差异,以便为建立牛胚胎干细胞培养体系提供实验依据。一、饲养层对牛胚胎干细胞的影响1.小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞做饲养层对牛类胚胎干细胞培养的影响分别用小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)和牛胎儿成纤维细胞(BEF)做饲养层对牛类胚胎干细胞进行培养,发现两种饲养层都可形成具有干细胞形态特征的克隆。在BEF饲养层培养条件下干细胞生长速度慢,干细胞传至第五代后克隆边缘细胞与饲养层细胞融合,界限模糊。而在MEF饲养层培养条件下干细胞生长速度快,干细胞传至第十代仍保持未分化状态。2.饲养层密度对牛类胚胎干细胞的影响比较三种不同密度的小鼠胎儿成纤维细胞做饲养层对牛类胚胎干细胞分离培养的影响。结果显示,在密度为1.25×105/ml的饲养层上囊胚贴壁时间短,贴壁率高,初代克隆形成率高,最适合牛类胚胎干细胞的分离培养。二、囊胚的处理方法和接种密度对牛类胚胎干细胞分离的影响1.囊胚处理方法对牛类胚胎干细胞分离的影响本研究中分别采用链酶蛋白酶去除透明带的囊胚、自然孵化囊胚以及机械切割得到的内细胞团进行牛类胚胎干细胞分离培养。结果显示,自然孵化的囊胚贴壁时间短,贴壁率高,更有利于牛类胚胎干细胞的分离培养。2.囊胚接种密度对牛类胚胎干细胞分离的影响将自然孵化囊胚接种在24孔板中,每孔接种1-4枚囊胚。结果显示,每孔接种2枚囊胚的原代克隆率最高为76%。三、血清和IGF1对牛类胚胎干细胞分离的影响以密度为1.25×105/ml的胎鼠成纤维细胞为饲养层,24孔板每孔接种两枚自然孵化囊胚,用三种不同的培养液培养牛类胚胎干细胞,来确定血清和IGF1因子对牛类胚胎干细胞培养的影响。结果显示,普通血清和干细胞专用血清对牛类胚胎干细胞培养的影响不明显；添加10ng/mlIGF1的培养液,培养的牛类胚胎干细胞克隆集落生长最旺盛,形成的克隆最大,但传至五代后细胞明显分化,表明IGFl会促进牛类胚胎干细胞的生长但不利于干细胞多能性的维持。四、牛类胚胎干细胞的鉴定用DMEM/F12+15%FBS+0.1mMβ-巯基乙醇+O.1mM非必需氨基酸+双抗+10ng/ml LIF+10ng/ml bFGF培养液培养的牛类胚胎干细胞进行OCT-4、SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-61的免疫荧光检测和Nanog、Oct-4和Sox-2的RT-PCR检测,结果均为阳性。并对不同形态和代次的牛类胚胎干细胞做了碱性磷酸酶检测,结果为阳性。证明了本实验所培养和收集的牛类胚胎干细胞具有干细胞特性。五、不同形态牛类胚胎干细胞的mRNA差异显示与鉴定1.差异基因的mRNA表达量检测本研究利用DDRT-PCR筛选片状、块状与泡状三种形态牛类胚胎干细胞差异表达的基因,并用实时定量PCR(Real Time Quantitative PCR)分析差异基因在不同发育阶段的表达丰度。筛选得到6个差异片段,经测序和GenBank数据库比对分析,这6个片段与已知基因有较高的同源性,分别为RPL9、LOC100850994、AMP、RPL31、Erbb2ip、CLIP1。通过实时定量PCR检测这6个基因的表达量,并用SPSS统计分析软件对实时数据进行了统计,结果表明,RPL9在块状和泡状中的表达量分别是片状的0.67倍和1.46倍(P<0.01)；LOC100850994在块状和泡状中的表达量分别是片状的0.33和2.73倍(P<0.01)；RPL31在块状和泡状中的表达量分别是片状的0.71(P<0.05)和1.58倍(P<0.01)；AMP、Erbb2IP和CLIP1在片状与块状中的表达量无显著差异(P>0.05),而在泡状中的表达量分别为片状的2.11、1.43和1.61倍(P<0.05)。2.差异基因的蛋白表达量检测用Western blotting检测各差异基因在不同形态中蛋白表达情况,以片状牛类胚胎干细胞为校准组,以a-tubulin为内参基因。结果显示,RPL9在片状细胞中表达量最高,泡状次之,块状细胞中表达量最低(P<0.05)；RPL31在片状和泡状细胞中表达量基本相同(P>0.05),在块状细胞中表达量显著降低(P<0.05)；AMP和CLIP1在三种形态中的蛋白表达量没有显著差异(P>0.05)。六、不同代次牛类胚胎干细胞的mRNA差异显示与鉴定1.差异基因的]mRNA表达量检测本研究利用DDRT-PCR筛选第一、五和十代不同代次牛类胚胎干细胞差异表达的基因,并用实时定量PCR(Real Time Quantitative PCR)分析差异基因在不同发育阶段的表达丰度。结果筛选得到7个差异片段,经测序和GenBank数据库比对分析,这7个片段与已知基因有较高的同源性,分别为IK、TKDP1、BZW、RPL31、PRL9、 RP42、IGBP1。通过实时定量PCR检测这7个基因的表达量,并用SPSS统计分析软件对实时数据进行了统计,结果表明,IK、TKDP1、 BZW、PRL9、RP42、IGBP1在第十代中的表达量较第一代均显著降低(P<0.05),仅RPL31表达量无显著差异(P>0.05)。2.差异基因的蛋白表达量检测用Western bloting检测各差异基因在不同代次中蛋白表达情况,以第一代牛类胚胎干细胞为校准组,以α-tubulin为内参基因。结果显示,各检测蛋白在第一代的表达量均显著高于第十代(P<0.05)。