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目的:肝癌侵袭转移和耐药是不良预后及进展的主要原因,肝癌是典型的富血管恶性肿瘤且存在血管生成拟态。Regorafenib于2017年被FDA批准用于不可切除肝癌的二线治疗药物,但是Regorafenib在肝癌转移中的治疗功效及作用机制尚不清楚。本论文第一部分旨在考察Regorafenib对肝癌细胞侵袭转移及VM形成的影响并探明相关分子机制。长期用药,Regorafenib面临耐药风险,前期我们已筛选肝癌Regorafenib耐药细胞,但其耐药机制尚需深入研究。本论文第二部分旨在表征肝癌Regorafenib耐药细胞的侵袭转移和VM形成等特征,筛选潜在逆转耐药靶点并探讨相关机制。上述研究将为临床上肝癌复发转移治疗及Regorafenib的合理用药提供有效策略。方法:1、第一部分:（1）分别采用CCK8、Transwell小室、管状形成和Western blot实验考察Regorafenib对肝癌细胞增殖、迁移侵袭、VM形成、EMT及VM相关蛋白表达的影响。（2）采用RNA-seq、Western blot及q RT-PCR筛选并验证Regorafenib治疗肝癌的潜在靶标,采用CETSA和基因敲减、回补实验证明ID1是Regorafenib的靶标。（3）采用Western blot、免疫组化、CD34-PAS双染等方法分析肝癌样本中ID1与EMT、VM蛋白表达相关性。（4）采用基因sh RNA和过表达等实验探讨ID1调节Snail介导肝癌细胞增殖、迁移侵袭和VM形成的作用机制,进一步采用裸鼠尾静脉肺转移模型进行体内验证。（5）采用肝癌PDX模型,体内考察Regorafenib对肿瘤中EMT及VM的影响。2、第二部分:（1）采用低浓度梯度间歇诱导筛选MHCC-97H/Rego耐药细胞,分别采用CCK8、Transwell小室、管状形成和Western blot实验分析耐药细胞的耐药性、增殖、迁移侵袭、VM形成、EMT及VM相关蛋白表达等特征。（2）采用RNA-seq、Western blot及q RT-PCR筛选并验证CD90是肝癌Regorafenib耐药细胞的重要靶标。（3）采用裸鼠皮下成瘤和CD34-PAS双染考察耐药细胞的肿瘤生长及VM结构,采用Western blot及免疫组化考察肿瘤组织中CD90及EMT、VM相关蛋白表达。（4）采用基因sh RNA实验考察CD90敲减对耐药细胞特征的影响,并进一步在裸鼠肺转移模型中验证。（5）采用GEPIA数据库分析临床肝癌样本中CD90与Pin1表达相关性,采用Western blot检测耐药细胞中CD90敲减对Pin1表达的影响。（6）采用Western blot分析肝癌标本中Pin1与Gli1表达相关性,进一步采用基因sh RNA、过表达及点突变,Co-IP、GST-pull down、CHX等实验探讨Pin1/Gli1信号轴对耐药细胞特征的影响及作用机制。（7）采用CCK8、Transwell小室、管状形成和Western blot实验考察Dasatinib对耐药细胞增殖、迁移侵袭、VM形成、EMT及VM相关蛋白表达的逆转情况。结果:1、第一部分:（1）肝癌细胞经Regorafenib预处理48 h,细胞迁移侵袭及VM形成能力减弱,而细胞增殖能力不受影响;Regorafenib抑制EMT相关蛋白Snail、Vimentin及VM相关蛋白VE-cadherin表达。（2）基于RNA-seq筛选并验证Regorafenib显著下调ID1表达;CETSA实验结果表明Regorafenib与ID1结合后热稳定性增强,ID1敲减降低了Regorafenib对肝癌细胞迁移能力的抑制作用,ID1回补可以恢复Regorafenib对细胞迁移能力的影响,表明ID1是Regorafenib的直接靶标。（3）在临床肝癌标本中ID1与Vimentin及VE-cadherin表达呈正相关,与E-cadherin表达呈负相关;ID1高表达的肝癌组织中CD34-PAS+的VM阳性结构多于ID1低表达组织。（4）ID1与Snail表达呈正相关;ID1敲减后,肝癌细胞迁移侵袭、VM形成及体内转移能力减弱,Snail过表达可增强sh ID1细胞的迁移侵袭及VM形成能力,并恢复其EMT及VM相关蛋白表达;ID1过表达增强肝癌细胞EMT、VM相关生物学行为及蛋白表达,Snail敲减可抑制其功能。（5）在肝癌PDX模型中,经15 mg/kg Regorafenib治疗后,肿瘤体积变小、VM结构减少;Regorafenib显著抑制肿瘤组织中ID1、Vimentin、Snail、VE-cadherin表达并促进E-cadherin表达。2、第二部分:（1）成功筛选MHCC-97H/Rego耐药细胞,耐药细胞具有增殖、迁移侵袭及VM形成能力增强,EMT及VM相关蛋白表达增加等特征。（2）基于RNA-seq筛选并验证肝癌Regorafenib耐药细胞中CD90异常高表达,提示CD90是逆转肝癌Regorafenib耐药的重要靶标。（3）肝癌Regorafenib耐药细胞的体内成瘤能力增强,组织中CD34-PAS+结构增多,CD90、Snail、Vimentin及VE-cadherin表达增加。（4）CD90敲减使肝癌Regorafenib耐药细胞迁移侵袭及VM形成能力减弱,体内肺转移能力降低,并下调Snail、Vimentin及VE-cadherin表达。（5）GEPIA数据库分析表明CD90与Pin1表达呈正相关,CD90敲减可降低Pin1表达。（6）Pin1敲减使耐药细胞迁移侵袭、VM形成能力减弱,并下调EMT及VM相关蛋白;Pin1过表达增强肝癌细胞EMT及VM相关生物学行为并上调其相关蛋白表达;肝癌标本中Pin1与Gli1呈正相关,Pin1与Gli1相互作用并调控Gli1蛋白稳定性介导耐药细胞迁移侵袭、VM形成及相关蛋白表达。（7）Dasatinib使肝癌Regorafenib耐药细胞迁移侵袭、VM形成能力减弱,下调CD90/Pin1/Gli1信号轴及下游EMT、VM相关蛋白,提示其可用于逆转肝癌Regorafenib耐药。结论:Regorafenib通过靶向ID1介导的EMT抑制肝癌细胞侵袭转移及VM形成,为Regorafenib用于肝癌转移治疗提供理论支撑。CD90调节Pin1表达进而调控肝癌Regorafenib耐药细胞的侵袭转移及VM形成,Dasatinib可通过抑制CD90/Pin1/Gli1轴逆转肝癌Regorafenib耐药,揭示了Regorafenib耐药的新型分子机制。本研究为肝癌复发转移提供治疗策略,对临床上Regorafenib的合理用药及其耐药逆转具有指导意义。