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背景免疫逃逸是癌症难以治愈最重要的特征之一。如何采取有效手段重启被肿瘤免疫逃逸所阻断的免疫反应,调动免疫细胞对肿瘤细胞的主动杀伤,成为根治肿瘤的关键问题。基于该理念,以嵌合抗原受体改造T/NK细胞(CAR-T/NK)为代表的肿瘤免疫疗法已取得了肿瘤治疗的新突破。然而,近期发现经CAR-T治疗的患者出现较多预后复发案例,这与肿瘤细胞表面抗原丢失造成的免疫逃逸有关。因此,如何应对肿瘤表面抗原丢失所产生的免疫逃逸成为肿瘤免疫疗法尤其是新一代CAR设计亟待解决的问题。目的分析NKG2D与配体复合物的蛋白质结构,设计并构建出兼具膜结合型MICA和可溶性MICA(sMICA)靶向识别与响应能力的嵌合抗原受体,探讨该受体对sMICA的响应能力,为增强NK92细胞的抗肿瘤活性研究提供理论依据。方法以NK细胞主要活化受体NKG2D为CAR的构造元件,应用蛋白质三维结构预测工具对NKG2D-CAR嵌合蛋白进行结构建模分析,获得与可溶性MICA结合形成三聚体结构的设计。将所设计的NKG2D-CAR进行全基因合成,插入到改造的pCDH-CMV-MCS-copGFP-Puro慢病毒载体上。本课题通过使用慢病毒转染NK92细胞,嘌呤霉素抗性筛选进行富集,获得可稳定高表达NKG2D-CAR的NK92细胞株,简称NKG2D-CAR-NK92。通过qPCR、流式细胞术与Western blot等方法鉴定NKG2D-CAR的蛋白表达水平。应用ELISA法,测定NKG2D-CAR-NK92细胞经不同浓度MICA蛋白孵育后IFN-γ因子释放量的变化。流式细胞术检测NKG2D-CAR-NK92细胞表型和各种癌细胞的MICA/B的表达。荧光素酶法或乳酸脱氢酶(LDH)法比较NK92、pCDH-NK92和NKG2D-CAR-NK92对人胃癌细胞SGC-7901和SNU-1、人黑色素瘤细胞A2058和人淋巴瘤细胞Raji的细胞毒作用。结果1、通过跨膜蛋白三级结构建模成功设计出具有MICA响应潜力的NKG2D-CAR。2、成功构建NKG2D-CAR表达载体,经慢病毒转染获得可稳定高表达NKG2D-CAR基因的NK92细胞株。3、不同浓度的MICA蛋白孵育后NKG2D-CAR-NK92细胞的IFN-γ因子释放量均高于NK92细胞,且呈现先增高后降低的趋势,和生化建模结果一致。4、细胞毒性实验验证NKG2D-CAR-NK92细胞能有效识别并显著增强对MICA/B阳性癌细胞的杀伤作用。结论本课题成功构建一种能响应可溶性MICA的嵌合受体修饰的NK92细胞株(即NKG2D-CAR-NK92),该细胞可显著增强对MICA/B阳性癌细胞的杀伤能力,遏制可溶性MICA引起的免疫抑制作用。