天然产物一直是新药分子的重要来源。受限于现有技术手段,已知的生物活性成分经常被重复分离,大大降低了药物先导化合物的发现效率。随着基因测序技术和生物信息学分析手段的发展,人们意识到真菌基因组中所隐藏的生物合成基因簇要远远多于目前已发现的天然产物。如何通过基因挖掘(genome mining)快速发现活性天然产物,已成为越来越多科学家关注的热点。杂萜(meroterpenoid)是部分结构来源于蔽类生物合成途径的天然产物。许多真菌可以合成杂萜,其复杂结构和显著活性促使着科学家们从真菌中不断发掘新型杂蔽分子。通过数据挖掘,我们在两株真菌Arthrinium sp.NF2194和Nectria sp.Z14-w中发现了两条同源杂萜基因簇,且均未报道,故推测这两株真菌很可能产生新型杂萜。于是,本论文集中于相关杂萜的分离鉴定与生物合成途径的阐释。全文共分三章:第一章,简要综述目前真菌杂萜化合物的结构、生物活性及生物合成的研究进展。第二章,利用生物信息学手段在两株真菌基因组中分析鉴定出两个杂萜生物合成基因簇(分别命名为atn和ntn),并通过功能注释和序列分析确定两个基因簇高度同源但略有不同。由于两个基因簇都未曾报道,其控制合成的产物很有可能为新化合物。为了进一步分离得到相关产物,我们利用RT-PCR技术检测不同培养条件下两基因簇中基因的转录情况,并选择一高转录条件进行大规模发酵。最终从Arthrinium sp.NF2194中分离得到了六个新杂萜化合物arthripenoids A-F(1-6),从Nectria sp.Z14-w中分离得到两个新杂萜化合物nectripenoids A-B(7-8)。活性测试显示:arthripenoid C(3)可抑制刀豆蛋白A刺激下T细胞的增殖(IC50=8.8 μM),但是对正常T细胞增殖无影响。进一步研究发现,arthripenoid C(3)对ConA刺激下T细胞所释放的γ-干扰素(INF-γ)有抑制作用(IC50=4.2μM)。第三章,主要研究arthripenoid的生物合成途径。首先利用异源表达株Aspergillus ozryae NSAR1共表达聚酮合酶(polyketide synthase,下文缩写为:PKS)—atnG和atnH,通过诱导表达分离得到PKS的直接产物。此后对atn基因簇上9个关键基因进行逐一敲除,通过分离鉴定出所积累的10个中间产物或支路产物,我们对arthripenoid的生物合成过程做出了初步推断。为进一步验证其中两个后修饰酶(AtnJ和AtnB)的功能,我们分别表达并纯化了相关蛋白,并进行了体外功能验证。AtnJ可催化PKS直接产物(化合物11)C-11位的羟化脱羧,并通过18O2标记实验进一步验证其反应机理;通过LC-MS分析确定AtnB为酮基还原酶,可还原cochlioqunione类型化合物C-4的羰基,并且具有一定的底物宽泛性。在此基础上,通过生物合成比较分析,推测了 nectripenoid这类化合物的生物合成过程。综上,本论文通过对真菌基因组数据库的挖掘和分析,从Arthrinium sp.NF2194和Nectria sp.Z14-w中定位到两个杂蔽生物合成基因簇,并分离得到一系列新型杂萜化合物。通过生物信息学分析、基因敲除、基因异源表达以及蛋白体外功能研究,进一步阐明了 arthripenoid杂萜的生物合成过程。作为基因挖掘和与活性天然产物发现相结合的成功案例,本工作发掘了一系列活性天然产物,拓展了真菌杂萜生物合成途径的多样性,为新型药源分子的发现提供线索。