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盐胁迫作为非生物胁迫因子,严重影响植物的生长、发育、产量等,随着土壤盐渍化的日益严重,以及世界人口的不断增加,粮食的供给越来越紧张,因此如何开发利用盐渍化土地以及如何提高作物的产量是世界农业生产中的重要问题之一。 拟南芥因具有许多特殊的生物学及遗传学特征,使其在近些年以来成为研究植物基因功能的模式生物,在研究植物的耐盐方面也起到了非常重要的作用,目前提高植物胁迫耐性的遗传方法为,通过将新基因转入植物或改变植物现有基因的表达水平影响抗盐性程度,培育转基因抗盐植物。目前世界上已经通过各种方法建立了拟南芥的突变体库,为拟南芥基因的功能研究提供了良好的条件。 本实验以组成型激活标签突变体库和诱导型激活标签突变体库为基础,进行了拟南芥耐盐突变体的筛选,目的在于获得耐盐突变体并克隆相关耐盐基因。 RNase的主要生理功能是控制细胞内RNA的种类与数量分布,除参与核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解等过程外,还与某些植物的自交不亲和性、器官发生、宿主的防御机制,控制肿瘤血管生成、杀灭肿瘤细胞及抑制病毒复制等有关。 研究表明,大肠杆菌中YmdB基因在受到冷胁迫时可以抑制RNaseⅢ的活性,因此本实验对拟南芥中YmdB的同源基因AT1G69340、AT2G40600、AT5G01310进行了初步研究,通过TAIR网站购买得到特定位点突变的突变体,对其进行了表型分析和基因的功能研究。目的在于探究这三个基因在受到逆境胁迫时的表型以及与RNaseⅢ活性的关系。 在对AT1G69340基因的突变体胚胎发育的研究中发现,其可能为胚胎致死突变体,目前已报道拟南芥中有许多参与种子胚发育的基因与基因印迹有关,如SIN1、FIS1、MEA等。研究表明,MEA在胚胎形成之前(花发育期)不表达,在含有成熟配子的未受精的果荚中开始表达,在种子成熟后停止表达,受精后MEA的表达受基因组印迹的调控,父体来源的基因拷贝并不能减少胚胎致死。另外,父体来源的基因只在胚乳中沉默,在营养器官中不沉默。并且,母体效应基因对胚胎发育的影响与父体来源的基因的剂量无关,不论父体来源的基因剂量如何都不能改变母体效应基因对胚胎发育的控制。 本实验的主要目的在于获得拟南芥耐盐突变体以及对AT1G69340、AT2G40600、AT5G01310基因的突变体的表型分析和基因的功能研究。主要结果如下: 1.对T-DNA插入组成型串联增强子激活标签突变体库的4200个株系和诱导型激活标签突变体库的4100个株系的筛选,以及对初步筛选得到的56株突变体的后代进一步验证,未得到可稳定遗传的耐盐突变体。 2.对突变体CS808255、CS839860(T-DNA插入位点为AT1G69340),CS830160、CS823606(T-DNA插入位点为AT2G40600),Salk_024760c、Salk_080565c(T-DNA插入位点为AT5G01310)进行了插入位点基因型的鉴定,除CS808255、CS839860外其他均得到纯合植株。 3.构建了基因AT1G69340、AT2G40600的GUS、GFP表达载体,并进行了花序侵染,已收获种子。 4.对突变体CS808255、CS839860进行了种子的胚胎发育的观察研究并对其花粉进行了染色和活力测定,结果显示,突变体的种子在开花后8-9d时的胚胎发育略滞后于野生型种子的胚,并且突变体与野生型的花粉活力和萌发情况相似,基本没有区别。 5.用实时定量PCR的方法观察了在不同胁迫条件处理下拟南芥叶中基因AT1G69340、AT2G40600、AT5G01310的表达变化,结果显示除300mM甘露醇处理3h以及38℃3h后转移至25℃4h这两种处理时基因AT5G01310的表达明显上升外,其他均无明显变化。